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1、第三章 基因工程载体,基因克隆载体,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。 基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。,载体的功能及特征,一、发展概况 1.第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3.
2、第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,载体应具备的条件,在克隆载体DNA分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 克隆载体必须是安全的。,第一节 质粒克隆载体,一、 质粒的一般生物学特性,发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母
3、 独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。 比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。,一、质粒的一般生物学特性,质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子 在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。 在体外理化因子作用下，质粒可以成为开环DNA分子（oc-DNA）或线形DNA分子（l-DNA）。 在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。 质粒DNA分子大小1-100Kb以上。,质粒DNA的复制,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯
4、双向性（F质粒）；既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 数个 拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,质粒的不亲和性,有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在
5、细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,质粒迁移,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由
6、bom 和mob 基因决定,携带特殊的遗传标记,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义,质粒载体,二、构建质粒克隆载体的基本策略,1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。 2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。,
7、三、质粒克隆载体的构建,质粒克隆载体的设计和构建过程的原则 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 组装合适的选择标记基因。 选用合适的启动子。 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。,大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建,pBR322的构建是质粒载体构建的一个典范。 pBR322的亲本质粒 pSF2124，含有Amp抗性基因 pMB1，含有松弛型ColE1的复制起点（ori） Psc101，含有Tet抗性基因,大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建,1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质
8、粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的质粒pMB3(13.3Kb)。 pMB3 AATT黏性末端环化 导入大肠杆菌 pMB8(2.6Kb),EcoRI*,2、从质粒pSC101获得四环素抗性基因（Tetr)。 获得pMB9（5.3Kb),3、向pMB9引入Amp抗性基因。 pSF2124的Tn3体内易位至pMB9获得pBR312 (10.2Kb,具有Amp抗性基因和Tet抗性基因） pBR312 pBR313 (8.8Kb，除去 Amp抗性基因中的BamHI位点）,EcoRI*,4、,pBR313,pBR322(4.3Kb),pBR320(2
9、.8Kb),pBR318（6.3Kb),去除两个PstI,EcoRII片断去掉,酶切,酶切,体外重组,四、常用质粒载体类型,1、克隆质粒载体 2、表达质粒载体 3、多功能质粒载体 4、穿梭质粒载体,1、克隆质粒载体,克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体。 pBR322质粒 pUC系列的质粒载体,pBR322质粒,具有较小的分子量，大小4363bp 可以克隆大到6Kb的外源DNA片断 具有两种选择标记，即Ampr和Tetr。 具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点 Amp抗性基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，Tet抗性基因可被BamH I, Hind II
10、I切开，通过插入失活筛选重组子。 在宿主细胞内具有较高的拷贝数。 一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。,CAP protein binding site - 591-554 (compl. strand); mRNA (LacZ) starts at nt position 507 (compl. strand); lac repressor binding site - 507-487 (compl. strand).,pBR322插入失活效应,筛选重组子的示意图,利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程,pUC系列的质粒载体,pBR
11、322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因 位于lacZ基因中的靠近5”端的一段多克隆位点(MCS ，multiple cloning sites)区，但它并不破坏该基因的功能,Multiple Cloning Sites pUC18,pUC19,pUC系列质粒载体的优点,具有更小的分子量和更高的拷贝数 pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因的缺失 适用于组织化学方法检测重组
12、体 LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做互补。 具有多克隆位点MCS区 pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点 具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,利用菌落颜色筛选重组子,2、表达质粒载体,是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源
13、蛋白质的质粒载体 根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体 根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体,表达载体与克隆载体的区别,强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性,表达型载体（expression vector）,特点 基因的启动子序列和终止子序列 一般无检测标记基因 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后） 重组分子用凝胶电泳检出
14、（依赖于分子量差异）。 结构 转化单元-宿主细胞转化 表达单元-外源基因表达,表达型载体（expression vector）,类型 型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+ 终止子 型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 + 终止子（常称之为表达分泌型载体）,三种表达型载体结构图,表达型载体（expression vector）,显然, 不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定, 表达载体的类型也就确定了。 用途 表达外源基因以产生大量外源基因产物 用于构建cDNA
15、文库,3、多功能质粒载体,载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。 pGEM 系列质粒载体就是一类多功能载体，如： pGEM-3、 pGEM-4、 pGEM-3Z、 pGEM4Z 、pSP64、 pSP65、 pGEM3Zf。,pGEM系列载体,pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。 在其总长度为2743bp的基因组DNA中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。 此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。,pGEM3Z载体,pGEM3Z与pUC载体非常相似 ，
16、其不同点： pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。 这两段启动子（噬菌体SP6T7)存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录。 合成的RNA可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,Pgem-3E,PSP6,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,1、克隆载体，全长3.19kb，具有Amp抗性基因和复制起始点 2、MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子-可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点 3、MCS为于lacZ基因内部（插入失活）蓝白斑筛选 4、引入丝状噬菌体f1(+) 复制起始点-可以产生单链DNA，并分泌至上清中，,分泌型融合表
