《(城乡、园林规划)基因工程综合性教学实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《(城乡、园林规划)基因工程综合性教学实验（75页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因工程综合性教学实验大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因克隆 表达 纯化吴海珍 王善利赵健 俞建瑛 张惠展华 东 理 工 大 学应用生物学系二五年一月第一部分碱性磷酸单酯酶基因的定位、克隆与表达实 验 流 程 图 碱性磷酸单脂酶基因在染色体DNA上的杂交定位Southern Blotting 碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增PCR扩增 PCR体外扩增片段的克隆连接于T-载体连接 连接产物转化大肠杆菌受体菌转化 转化子质粒DNA的抽提快速法制备质粒 转化子的鉴定限制性内切酶酶切 目的转化子DNA的大量制备碱法抽提质粒DNA 酶切回收克隆的目的基因片段回收目的基因 重组表达型质粒的构建连接、转化、鉴定 重组大
2、肠杆菌目的蛋白的表达蛋白电泳 实 验 路 线1 DNA的酶切摘要 本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种酶联合酶切的常用策略等。1.1实验原理DNA重组技术中的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或质粒DNA）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相对应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。限制性核酸内切酶几乎存在于任何一种原核细菌中，它能在特定位置上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。早在20世纪50年代初微生物体内的限制核修饰作用就已发现，10
3、年后细菌的限制和修饰作用的分子机制被阐明。以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制修饰系统，两种不同来源的噬菌体（lK和lB）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。这一现象普遍存在与原核细菌中。但由于宿主细胞内的降解作用的不完全，入侵的DNA分子总有极少数能完
4、整保留下来并得以在细胞体内复制，而且在复制过程中被宿主细胞的甲基化酶所修饰。这修饰过的DNA分子再重新制备后导入该宿主细胞时，感染频率又能恢复到原来的高位，即限制修饰作用被解除。1.1.1限制性核酸内切酶的分类目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质不同可分为三大类（见表1-1）。其中II类限制性核酸内切酶与其所对应的甲基化酶是分离的，不属同一酶分子，而且由于这类酶的识别切割位点比较专一，因此广泛用于DNA的重组实验。I类和III类酶严格地说应该称为限制修饰酶，因为它们的限制性核酸内切活性及甲基化活性都作为亚基的功能单位，包含在同一酶分子中。表1-1各类限制性内切酶的特性I类酶
5、II类酶III类酶酶分子三亚基双功能酶内切酶和甲基化酶分开二亚基双功能酶识别位点二分非对称序列46bp短序列，大多数为回文结构57bp非对称序列切割位点距离识别位点至少1 000bp，无特异性在识别位点中或靠近识别位点在识别位点下游2426bp处限制性反应与甲基化反应互斥分开的反应同时竞争限制作用所需的辅因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（非必需）DNA重组中的用途无有无1.1.2 II类限制性核酸内切酶的基本特性II类限制性核酸内切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双DNA的识别与切
6、割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组实验中广泛使用。目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的酶NEB（New England Biolabs）公司品种最多，达220余种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。这些酶的统一命名由酶来源的生物体名称缩写构成（见图1-1）图1-1 限制性内切酶的命名原则与示例1.1.2.1识别位点II类限制性内切酶的识别位点具有180旋转对称的回文结构，常用的识别序列往往为6个碱基对，例如HindIII的识别序列：其中一部分的识别序列某一或某两位碱基并非严格专一，但都在两
7、种碱基中具有可替代性，这种不专一性并不影响内切酶和甲基化酶的作用位点，只是增加了DNA分子上的酶识别与作用频率，例如AvaI的识别序列就是典型的结构：有的酶识别位点为4或5碱基对，如AluI、HaeIII和Sau3AI（见图1-2）等，在DNA上的出现频率则较高，而象Sau3AI切割DNA后产生的是粘性末端，且与BamHI切割后的粘性末端相同，为大规模克隆提供了可能。实际应用中利用Sau3AI高频现象，结合DNA的部分酶切策略进行研究也是常用的实验手段。图1-2 限制性内切酶的命名原则与示例另外一些不常见的酶识别位点相对较长，在DNA链上出现频率也相对较低，如FseI（5-GGCCGGCC-3
8、），出现频率为1/48 = 1/65kb。实际上由于不同生物体的DNA碱基含量不同，酶的识别位点的分布和频率也不同。大肠杆菌基因组中AT含量较丰富，所以富含AT的识别序列（如DraI：5-TTTAAA-3；PshBI：5-ATTATT-3；SspI：5-AATTAA-3）较为频繁的出现，而链霉菌基因组因GC含量高，相应的富含GC碱基对的识别序列（NaeI：5-GCCGGC-3；SmaI：5-CCCGGG-3；SacII：5-CCGCGG-3）较常见。1.1.2.2粘性末端限制性内切酶切割DNA产生的末端根据被切开的DNA末端性质的不同（不考虑碱基序列）可分两大类：平端和粘端，而后者又可分为3-
9、OH突出或5-P突出两种，分布情况见图1-3，故DNA分子的连接通常发生在同种限制性内切酶酶切后的DNA间。图1-3 DNA酶切产生的三种末端实际上DNA重组应用中，由于不同限内酶酶切能产生相同粘性末端，因此DNA分子的连接可发生在不同限内酶之间，常见的DNA分子连接情况见图1-4。而在重组工作中如没有合适的酶切口产生相同的粘性末端，则可对酶切后的突出粘性末端进行补平，采用平头连接策略。图1-4 DNA粘性末端的连接效果1.1.2.3甲基化影响大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位
10、置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。1.1.2.4近末端切割基因工程的操作中经常要对DNA片段进行精细切割，在PCR产物中有些甚至只切割一个碱基对。不同的内切酶对裸露的酶切位点不能切断，因
11、此必需在酶切位点外侧加上一个或几个保护碱基，表1-2中列举了常用的十五种内切酶在不同保护碱基下的切割效果，一般保护碱基大于三个碱基对时能完全切割。但是在有些PCR产物中即使保护碱基大于五时也不一定能被有效切断，这可能是PCR产物纯化中残留的杂质影响酶切或是PCR产物末端聚合不完整。表1-2 DNA末端酶切位点的切断情况Enzyme末端碱基数0123BamHI-+BglII-+ClaI-+EcoRI-+EcoRV-+HindIII-+KpnI-+NcoI-+PstI-+SacI-+SalI+SmaI-+SphI-+XbaI-+XhoI-+-：不能切断；不能完全切断；+：完全切断1.1.3限制性核
12、酸内切酶的使用限制性核酸内切酶在基因工程属常用工具酶，主要用于基因物理图谱的绘制、基因片段的鉴定或获得、用于杂交的DNA探针的制备等，而酶切的条件控制则是非常重要的。1.1.3.1作用条件在DNA的酶切反应中酶切条件是酶切成功的关键，主要影响因素有：（1） 反应温度 常规酶切反应均在37进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30，故最好根据所选用的酶确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切（见1.1.3.3）。（2） 缓冲体系 厂商提供的限制性核酸内切酶有其相对应的缓冲液，一般的缓
13、冲液种类为4-10种左右，按盐离子浓度可分为三大类：高盐、中盐和低盐。缓冲液配制为10的母液，酶切时稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表（宝生物工程公司）选择缓冲液或采用万能缓冲液（Promega）。（3） 反应时间 常规酶切反应时间为1.5小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长23小时，有时甚至可以过夜。一般来说，在DNA量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA时，可以考虑酶切过夜。另对特殊实验，如对基因组DNA进行部分酶切，则在酶量投入一定的前提下，减少反应时间降低对DNA切割的程度。（
14、4） 加入酶量 在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。但实验中常常出现酶量加入过多酶切效果反差的现象，这主要是酶的储存液中含有50的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star活性）。（5） DNA纯度 在满足上述条件下影响酶切效果的主要因素是DNA的纯度，DNA样品中蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）的残留、高浓度的RNA等。另外DNA浓度过高也会导致酶切失败，一般DNA的质量浓度在1mg/ml体系中能取得好的酶切效果。当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大（如从15ml-30ml），将杂质相对浓度稀释，这样不需多增加酶量就能取得较好的酶切效果1.1.3.2酶切方式酶切方式可分为部分酶切与完全酶切：（1） 部分酶切 指的是同一DNA片段上的位点有些被切开而另一些未被切开，此法主要用于基因的克隆。在某些基因内部可能有此酶的切点，用完全酶切进行克隆时难以得到完整基因。部分酶切实施方法：a）在不同的时间从同
