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1、第18章,高效液相色谱法,高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高压技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分离分析方法。,概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径15cm, 长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150200m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时
2、，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（310 m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。,HPLC与经典LC区别,HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,HPLC与GC差别,相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别,1分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、
3、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性,3操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室
4、温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,HPLC的特点和应用,“三高” “一快” “一广”,高柱效远高于一般LC 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）,第一节 高效液相色谱法的主要类型与原理,一 主要类型,四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 化学键合相色谱法,将固定液的官能团键合在载体的表面，而构成化学键合相。 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法（BPC）。,二 化学键合
5、相色谱法,（一）正相键合色谱法,1分离机制： 分配过程：组分在两相间进行分配，极性强的组分分配系数大 吸附过程：溶质分子与固定相之间定向作用力 诱导力、或氢键作用力 2固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tR，k 5出柱顺序： 结构相近组分，极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱。 6适用： 分析极性大物质、糖类等。,（二）反相键合相色谱,1分离机制：疏溶剂理论 把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子
6、毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时： 一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。,另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。 这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。,保留机制 疏溶剂理论（solvophobic theory）,溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间的色散力，,2固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）
7、 3流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF,4保留行为的影响因素： 1）溶质的分子结构： 溶质极性，疏水性，k，组分tR 2）流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，k，组分tR 3）固定相： 碳链，疏水性，k，组分tR 5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6适用： 非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,正相和反相键合色谱法,在HPLC分析中，有时要在流动相中加入适量的盐(碳酸铵、四烷基铵盐)或酸，为什么？答：都是为了防止峰形拖尾。加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作
8、用；加入酸是抑制酸类待测物的离解，使其以游离酸在柱内分离。,（三）反相离子对色谱法,离子对色谱法（ PIC ）可分为正相与反相离子对色谱法，前者已很少用。 反相离子对色谱法是把离子对试剂加入极性流动相中，被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的中性离子对，从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，改善分高效果。,1分离机制 离子对模型,非极性或弱极性,2. 影响容量因子的因素 1) 离子对试剂的种类 分析碱类或带负电荷物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐 分析酸类或带正电荷物质：用四丁基季铵盐 2）离子对试剂浓度，k， tR 3）与R的链长有关：R，极性，k，tR，
9、4）流动相的pH 对弱酸弱碱影响大，对强酸强碱影响小 试样离解程度，越有利于离子对的形成，k,3用途 适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物的分离。 可以避免用普通的HPLC仪器长期进行IEC时，流动相（酸、碱）对泵与流路的腐蚀。 此法在药物分析中应用很广,（四）离子抑制色谱法 在反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（ISC）。 1.离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液,2. k的影响因素： 与流动相极性有关，还与pH值有关 选择流动相
10、：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子 3.适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,（一）离子色谱法 离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。 为解决此问题，1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通
11、过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。,三 其他高效液相色谱法,该法可以分析无机与有机阴、阳离子和氨基酸，以及糖类和DNA、RNA的水解产物等。 该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。,（二）手性色谱法： 用手性固定相或在流动相中加入手性添加剂，分离、分析立体异构体的方法，称为手性色谱法 (CC）。 手性色谱法是分析与直接拆分对映体的重要手段。制备单一活性异构体，替代外消旋药物是当今制药业的发展趋势，手性固定相将起
12、到重要作用。但由于手性色谱柱价格较贵，该法尚不普及。,（三） 亲和色谱法(AC),原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,第二节 HPLC固定相和流动相及其选择,固定相,一 化学键合固定相,化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定
13、相。,按结构分，键合相可分为四种键型： （1）硅酸酯型（Si-O-C）键合相 （2）硅氮型（ Si-N ）键合相 （3）硅碳型（ Si-C ）键合相 （4）硅氧烷型（ Si-O-Si-C ）键合相,按极性分，键合相可分为三种 （1）非极性键合相 （2）弱极性键合固定相 （3）极性键合相,（1）非极性键合相 表面基团为非极性羟基，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基（C1）、苯基等。 常用于反相色谱 非极性键合相的烷基链越长，稳定性越好，溶质的K越大，载样量越高，分离选择性越好。,时间，min,固定相：C1,固定相：C8,固定相：C18,硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响 1-
14、尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯,可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。,（2）弱极性键合固定相 常见的有醚基和二羟基键合相 可用于正相或反相色谱 （3）极性键合相 常用氨基、氰基键合相 一般用于正相色谱,表示方法： 国产：YWG-C18H37 YQG-C18H37 YWG-CN YQG-NH2 YWG-C6H5 进口：Spherisorb ODS Lichrosorb -CN,特点： 1）不易流失 2）热稳定性好 3）化学性能好 4）载样量大 5）适于梯度洗脱 使用时应注意： 1）流动相pH应在28，否则会引起硅胶溶解 2）不同厂家，不同批号的
15、同一类型键合相也可能表现不同的色谱特性。,二 化学键合相色谱法的流动相 理想的溶剂应有下列特性： 与固定相不发生化学反应。 对试样有适宜的溶解度。使k在1-10范围内， 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。,4）高纯度。 否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加； 5）低的粘度。 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。,（一）流动相对分离的影响
16、 n由色谱柱（固定相）性能决定， 主要受溶剂种类的影响， k受溶剂配比的影响。,（二）流动相的强度和选择性 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 溶剂的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）,（一）高效液相色谱中的速率理论 van Deemter方程 ： H = A + B / u + C u 1.涡流扩散项 A 2dp A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关,三、分离条件的选择,2.纵向扩散项 B / u 纵向扩散项系数为 B = 2 Dm 式中： 弯曲因子， Dm组分在流动相中的扩散系数 Dm与流动相的粘度（）成反比，与温度成正比。由于液体的粘度比气体大得多（约102倍），且在常温下操作，因此组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，故在液相色谱中B可以忽略。,3 传质阻抗 由三个系数组成： C Cs CmCsm Cs固定相传质阻抗 Cm
