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1、基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第14章,DNA克隆、测序与重组技术的历史,1973年，Stanley Cohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆,DNA克隆、测序与重组技术的历史,1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的化学裂解DNA测序问世 不久，Sanger 等的双脱氧测序法,DNA克隆、测序与重组技术的历史,20世纪90年代启动人类基因组计划(human genome project，HGP) 重组DNA技术学(Recombinant DNA Technology),Craig
2、 Venter,第一节自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature,DNA重组,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。,一、同源重组是最基本的DNA重组方式,Holliday模型的4个关键步骤：,两
3、个同源染色体DNA排列整齐；,一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；,通过分支移动产生异源双链DNA；,Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,是在二倍体生物细胞中，形态、结构基本相同的染色体，并在减数第一次分裂的四分体时期中彼此联会，最后分开到不同的生殖细胞（即精子、卵细胞）的一对染色体，在这一对染色体中一个来自母方，另一个来自父方。,同源染色体,Holiday中间体,片段重组体 （见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体（见模型图左边产物
4、）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,5,片段重组体,拼接重组体,片段重组体,拼接重组体,Potter H.和Dressler D.在噬菌体中的拍摄到“十”字型结构的DNA电镜照片，为Holliday模型提供了一个有力的证据。,二、细菌的基因转移与重组有四种方式,（一）接合作用,当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。,质粒是染色体以外能自身独立复制的超螺旋共价闭环双链DNA分子。,质粒,可接合质粒如 F 因子(F factor),（二）转化作用,通过自动
5、获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。,（三）转导作用,当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。,噬菌体的生活史,溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway),（四）细菌融合,两个不同种类的细菌融合成为一个新的物种。,Two Bacteria Species Merging Into One,Camp
6、ylobacter jejuni and Campylobacter coli, as the intestinal organisms are known, arent just consummating their microscopic love by exchanging genes theyre merging into a single species, scientists say. The researchers think the marriage of the creatures represents a profound example of how people can
7、 affect evolution.,三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合,位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合； 反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。,（一）噬菌体DNA的整合,（二）细菌的特异位点重组,沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。,hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动
8、hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。,沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变,（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (r
9、ecombination activating gene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。,CACAGTG(12/23)ACAAAAACC,GTGTCCAC TGTTTTTGG,重组信号序列,基因片段,V,J,分子内转酯反应,单链切开 转移核苷酸 修复、连接,免疫球蛋白基因重排过程,保守的重组信号序列,四、转座重组,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。,大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。,插入序列(insertion sequences, IS)组成：,（
10、一）插入序列转座,二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列,特有的正向重复序列,一个转座酶（transposase)编码基因,插入序列发生转座的形式：,保守性转座(conservative transposition),复制性转座(duplicative transposition),插入序列的复制性转座,转座子(transposons) 可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。,（二）转座子转座,转座子组成：,反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因,细菌的可流动性元件 A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示) B转座子Tn
11、3：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因 C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L,由转座子介导的转座,第二节 重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆,DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DN
12、A技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系,本节主要内容：,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一） DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然
13、的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,DNA克隆,生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的： 分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,Genetic Engineering,First, the nucle
14、us of human cells are burst,Human cell,Nucleus,Genetic Engineering,The chromosomes are cut up into small fragments and the required gene identified.,Chromosome fragments,Fragment containing required gene,Genetic Engineering,Next the fragments are spread out and the required one isolated.,Segment wit
15、h required gene,Genetic Engineering,Cytoplasm,Bacterial chromosome,Bacterial cell wall,Plasmid,Structure of a typical bacterium,Genetic Engineering,Plasmid,Plasmids are loops of DNA separate from the main chromosome. They carry genes for things like antibiotic resistance. This makes them very useful
16、 to theGenetic engineer.,Genetic Engineering,In the above plasmid, the YELLOW gene is one that gives the bacterium resistance to one antibiotic (eg Penicillin).,P,T,The GREEN gene gives resistance to a different antibiotic (eg Tetracycline),Genetic Engineering,By using special enzymes, we can make a cut in the midst of ONE of theseantibiotic resista
