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1、四 重组蛋白质的鉴定,三 基因重组蛋白包涵体的分离和复性,二 常用的分离方法,一 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则,第八章 外源基因表达产物的分离纯化,一、 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则,针对不同的产物表达形式采取不同的策略,针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,多种分离纯化技术的联合运用,合适分离纯化介质的选择,分离纯化过程的规模化,1. 针对不同的产物表达形式采取不同的策略,采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；,采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；,采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首
2、先选用亲和层析进行纯化,表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。,2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型,等电点处于极端区域（pI5 或 pI8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；,重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析,疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；,凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；,3. 多种分离纯化技术的联合运用,在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：,应选择不同分离纯化机理的方法联合使用,应首先选择能除去含量最多杂质的方法,应
3、尽量选择高效的分离方法,应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段,4. 合适分离纯化介质的选择,常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。,理想的分离纯化介质应具有下列性质：,对目标蛋白具有较高的分离效率,对目标蛋白不会造成变性,化学性能和机械性能稳定，重复性好,价格低廉,Sephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒 Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的,5. 分离纯化过程的规模化,蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：,实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）,实验室方法在大
4、规模生产中可能成本过高（超速离心）,因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。,1. 离子交换层析,二、常用的分离方法,离子交换层析的基本原理,离子交换介质的基本性质,离子交换层析的基本操作,离子交换介质的选择原则,离子交换层析的基本原理,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技术。,离子交换介质的基本性质,离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物,如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；,离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用,离子交换剂
5、的基本性能,不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大,小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个,洗脱下来，达到分离纯化的目的,阴离子交换剂：强碱型和弱碱型,离子交换剂的分类,阳离子交换剂：强酸型和弱酸型,阳离子交换剂分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有RSO3H，中强酸型含有PO3H2、PO2H2或OPO2H2，弱酸型含有COOH或OH。 阳离子交换进行的反应如下：,阴离子交换剂分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐 N+(CH3)3 为强碱型，三级以下铵盐 N(CH3)2、 NHCH3、 NH2 都属弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中
6、强碱型。阴离子交换树脂进行的反应如下：,强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽,弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小,弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子,交换能力逐渐减弱,常用的离子交换剂,离子交换树脂：,最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯,乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物,离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，,因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化,离子交换纤维素：,离子交换纤维素是携带功能
7、基团纤维素衍生物，具有松散的亲水,性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大,分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大,阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等,维素）,阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤,离子交换葡聚糖：,离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三,维空间网状结构并带有离子交换功能基团。,Sephadex的优点如下：,亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核,酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小,电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快,既有离子交换作用，又有分子筛效应,因
8、而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质,常用的离子交换葡聚糖包括：,阳离子交换剂CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50,阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50,QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50,离子交换琼脂糖：,离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B,尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因,具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点,此具有稳定的外形体积,离子交换介质的选择原则,一般而言：,酸性物质用阴离子交换剂分
9、离,氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化,碱性物质用阳离子交换剂分离,曲线来选择,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,+,-,蛋 白 质 净 电 荷,等电点,吸附阴离子交换剂,吸附阳离子交换剂,pH pI（-）,对pI=5的某酸性蛋白质,在pH5.5-9.0的范围内，,当蛋白质为阴离子时，,应首选DEAE纤维素；,在pH3.5-4.5的范围内，,当蛋白质为阳离子时，,应首选CM纤维素,离子交换层析的基本操作,(1) 层析柱平衡,平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍,平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速,平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致,
10、为准，其中pH值最重要,目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定； 使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合； 使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。,(2) 样品进柱,为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%,为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高,交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数,离子交换层析的基本操作,(3) 样品洗脱,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,分子浓度,离子强度,pH值,1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合,2.吸附阶段：样品与反离子进行交换,3、4. 解吸附阶段：用
11、梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质,5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用,原始缓冲溶液的反离子,样品溶液,梯度浓度,时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH 值。 当pI pH时，蛋白质带净正电荷。,举一例子： 已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。 答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此
12、柱结合，然后盐梯度洗脱。,2. 凝胶层析,凝胶层析的基本原理,凝胶介质的基本性质,凝胶层析的基本操作,凝胶介质的选用原则,凝胶层析的基本原理,凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛。,分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；,鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,凝胶过滤层析过程示意图,凝胶过滤层析过程示意图,小分子,大分子,凝胶基质,凝胶珠,凝胶介质的基本性质,葡聚糖凝胶的种类有G1
13、0、G15、G25、G50、G75、G100,葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解,湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温,葡聚糖凝胶（ Sephadex ）,葡聚糖凝胶G10 700 葡聚糖凝胶G15 1500 葡聚糖凝胶G25 1000-5000 葡聚糖凝胶G50 1000-30,000,琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose,（ Sepharose 2B、4B、6B）。,琼脂糖凝胶,当温度高于50时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。,琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大,分子物质（如蛋白质和DNA）。,聚
14、丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联,而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交,联剂越多，孔隙越小。,聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种,聚丙烯酰胺凝胶,凝胶介质的选用原则,将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分,离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。,组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量,的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-,组别分离,15、Bio-Gel P-2或P-4,将样品中一些分子量比较接近
15、的物质分开，这种分离叫分级分离,分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。,在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由,分级分离,于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。,凝胶层析的基本操作,平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速,注意凝胶的断层和气泡,层析柱平衡,操作压控制,平衡和洗脱时应维持流速恒定,上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：,进样体积,进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%,进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能,窄，这样洗脱出的峰形好,3. 亲和层析,亲和层析的基本概念,亲和层析载体的性质与选择,亲和层析配基的性质与选择
16、,亲和层析的基本操作,亲和层析的基本概念,亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力,进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：,纯化过程简单、迅速，且分离效率高,特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子,亲和层析的基本特点,纯化倍数大，产物纯度高,必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件,因此应用范围受到一定的限制,抗原与抗体,DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA),酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子,激素或药物与其受体,具有特异性亲和作用的生物分子,维生素于其特异性结合蛋白,糖蛋白与其相应的植物凝集素,亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连,作为固定相吸附剂,当含有混合组份的样品（流动相）通过此
