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1、PCR引物设计原理,PCR反应一般由三个步骤组成： 模板的热变性； 引物复性到单链模板上； 热稳定DNA聚合酶催化的延伸,变性,在应用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 时，变性温度在94-95下进行，这也是Taq DNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不受到过多损失时能耐受的最高温度。 有时把变性时间设计为 5min，以便大分子模板 DNA 彻底变性的概率。 对于 GC 含量为 55% 或更低的线性 DNA 模板，推荐 PCR 的变性条件是 94-95 变性45s。,复性温度（退火温度）至关重要！ 退火温度太高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率会非常低； 退火温度太低，引物将
2、产生非特异性复性，从而导致非特异性DNA片段的扩增； 退火温度，通常比理论设计的引物和模板的Tm值低 3-5 下进行。 最好通过对复性温度比两条引物的Tm 值低 2-10 内进行PCR预实验（梯度）来对复性条件的优化。,引物和模板DNA 的复性,对 Taq DNA 聚合酶来说，最适温度为72-78 ，时间约为1min。,引物的延伸与循环数目,哺乳动物 DNA 为模板时，至少进行25个循环才能得到足够量的扩增产物。一般为30-33个循环。,引物设计要点,（1）碱基组成： GC含量应在40%-60%（ 45%-55% ）之间，4中碱基在引物中分配均匀。没有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如AAAAA等，没
3、有二核苷酸重复序列，如GCGCGC等； （2）引物长度： 引物中与模板互补的区应为18-25个核苷酸长度，上下引物长度差别不能大于3bp，如上游引物为19bp，下游引物为24bp等。,（3）重复或自身互补序列： 形成发夹结构，会阻止引物和模板之间的复性。,（4）上下引物的互补性： 一个引物的3末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上，因为PCR中引物浓度较高，会形成引物二聚体。 当一个PCR有多对引物时，注意检查任何一个3末端都不能和 其他任何引物互补。,（5）解链温度（Tm 值）： 计算出来的两个引物的 Tm 值相差不能大于5 ，扩增产物的 Tm 值与引物的 Tm 值相差不能大于10 ；引
4、物的 Tm 值一般为50-70。 这些特性保证了扩增产物在每一个 PCR 循环可有效变性。,（6）3末端 3末端的性质非常关键。 如果可能的话，每个引物的3末端碱基为G或C；最好不要A，或AA等多聚A； 但不推荐3末端有.NNNCG或.NNNGC序列的引物，GC高自由能促进发夹及引物二聚体产生。,当末端碱基为 A 时，错配时引发链合成的效率大大降低； 当末端碱基为T时，错配情况下亦能引发链的合成，所以一般 PCR 反应中，引物3末端的碱基最好选T、C、G，而不选A。 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，
5、错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。？ （7）5端序列添加限制性酶切位点：,一些概念,有意链（Sense strand），正义链（positive strand），编码链（coding strand）；无意链（anti-sense strand），负义链（negative strand），模板链（template strand）,正向引物 （forward primer）：处于DNA双链上游的引物。如用于测序，则从53方向读出 DNA正链的序列。 反向引物 （Reverse primer）：处于目的DNA双链下游的引物。如用于测序，则读出 DNA负链
6、从下游到上游的反向序列。,Primer Premier 5.0 软件设计引物,是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件 主要界面分为序列编辑窗口（genetank）、primer design、酶切分析（restriction site）和 Motif,正向（As is）、反向（reversed）、互补（complemented）及反向互补（reverse complemented ）。,正向（As is）,反向（reversed）,互补（complemented）,Enzyme,软件默认以表格方式显示酶切结果。单击Seq 或 Map，分别
7、以序列或图示的方式显示结果。缺点：不能以文本的形式保存结果。,Motif,Primer,点击 Search，进行引物搜索,Search criteria 窗口：多种参数可以调整。,Primer Length常设置在1830bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。,PCR Product size最好是100500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。,ManualSearch parameters 人工搜索参数设置窗口。,Search stringency应选High。,GC含量一般是406
8、0。,其它参数默认就可以。,Search progress 窗口中显示Search CompletedOK键,结果窗口有三种显示形式，上游引物、下游引物和成对显示。引物按优劣次序排列，满分为100。选其中的一对引物，在主窗口显示结果。,对于上述引物，如果其它各项指标还可以，可在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。,搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。,当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它。,引物3端2个A或T,或引物内部连续的G或C太多，或引物3端2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。,该图分为四部分：最
9、上面是图示模板及产物位置，“S”和“A”可查看有义链或反义链的引物。右边是两个引物在模板上结合位置的直观图；第二层是模板及引物序列的配对情况；第三层显示引物的各种参数。注意：尾末给出该引物的最佳退火温度！第四层：四种重要指标的分析,引物长度：控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度。长的PCR引物能给扩增带来更好的特异性，可以通过降低退火温度提高反应的灵敏度，不过长引物易形成包括发夹结构二聚体自身互补等二级结构。适宜引物长度为18-27 nt。,Tm 融链温度：根据相邻二碱基对作用原理来计算融链温度。PCR 反应的合适 Tm 范围为56-63 （50-70）,GC% 含量：对于PCR 反应
10、来说 GC含量在50% 左右比较合适。 （40-60%,45-55%）,Degeneracy多义性，尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，尽量避免3末端的多义性，因为这个位置即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。,BLAST 验证引物,进入http: /www.ncbi.nlm.nil.gov/BLAST/, 点击Basic BLAST中的 nucleotide blast 选项,在Enter Query Sequence栏中输入引物序列： 例：引物为5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3; 5-TGCCCATCACAACATCATCT-3 同时输入上下游引物。输入上下游引物都从
11、5 3。输入上游引物后，加上20个字母n，再输入下游引物。,在Choose Search Set栏中：Database根据预操作基因的种属定了，可选Human genomic + transcript或Others,在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：,在此界面最下面关键要点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。,在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size的下拉框将数字改为7。
12、,图中：序列与引物匹配的得分值小于40分、4050分、50-80分、80-200分等，分值越高，特异性越好；线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。两线段间没有连线的，表示单条引物与该基因一致。有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。,Accession，数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息,Desscription序列的简单描述,高的就是有两线段间有连线的,代表随机匹配的可能性。E值接近零时最有意义，也
13、就是说序列完全匹配了。,比对到的序列长度,E值越小为好！,匹配上的碱基数占总序列长度的比例,缺失或插入，用“-”来表示,Query1、2表示输入的两对引物，Sbjct表示在库里比对的序列,Primer BLAST的详细结果,ncbi 在线 primer 设计,默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500,至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。,用Oligo软件设计/评估PCR引物,启动Oligo，选择Fileopen，打开要进行引物分析的序列。,图中显示的三个
14、指标：Tm值、G和 Frequencies。,退火温度窗口是设计引物的主窗口，其他两个具有辅助作用。,因为分析要涉及多个指标，启动窗口的Cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为Tile方式。,用Tile方式显示窗口,Tm，退火温度窗口,Tm值曲线以选取72附近为佳； 5到3端的下降性状也有利于引物引发聚合反应。,圈出来的序列部分及黄色的bar即代表当前分析的21个碱基的Tm值,可点击窗口的左下角的Upper、Lower按钮选择上游引物、下游引物。,Tm值似乎太低了,Tm值似乎太高了,显示了装载的整个序列的 6-7 mers寡核苷酸顺序的相对频率。寡核苷酸的3端如果在一个特定
15、的数据库（GenBank的子数据库）更普遍（即出现的频率更高），那么更容易导致错误引发。,Frequencies，碱基频率窗口,如果选择出现频率较低的位点作为3末端，那么就减少了在复杂的底物（比如整个基因组DNA）内的许多位点结合、引发的几率，从而减少了非特异性PCR产物的形成。,平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。,G，序列内部碱基稳定性窗口,显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。,-1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6）,G值反应了序列与模板的结合强度； 最好引物的G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低。,在一个双
16、链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能G表示。,第二个核苷酸,第一个（5）核苷酸,例子：双链d（ACGG/CCGT）的G是： G（ACGG）=G（AC）+G（CG）+G（GG） =-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol,显示了3末端序列G值较低，适合引发。,3末端序列G太高。,你可以在三个窗口中自行设计引物。,选择了自己认为顺眼的位置，此时，点击Uper，上游引物即可显示。,同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。,对你设计的引物 质量进一步分析。,同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。,参数设置与搜索选择searchfor primers and probes，进行如右图设置。 点击search ranges，设置引物范围和 PCR产物的大小 点击parameters，进行参数设置。,因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选compatible pairs,默认下，对
