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1、水中细菌 总数与大肠菌群的测定,一 实验目的,1、掌握细菌总数的测定方法 2、掌握大肠杆菌的鉴定和计数方法 3、巩固无菌操作技术,1.细菌总数测定原理,用营养琼脂倾注平板，测定被检物在单位重量或体积（g或ml）内所含有的活细菌数量，以判明被检物被细菌污染的程度。,二 实验原理,2 大肠杆菌鉴定原理,大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否染肠道致病菌的可能。 样品中大肠菌群系以100mL（g）检样内大肠菌群最大可能数（MPN)表示。,细 菌 学 检 验 程 序 样品 细菌总数 大
2、肠菌群 水样稀释或不稀释 水样稀释或不稀释 第一步- 初步发酵试验 倾注平板培养 （乳糖发酵） 37 24小时 37 24小时 菌落计数 第二步- 平板分离培养 （取平均数报告） （转种鉴别培养基） 37 24小时 革兰染色镜检 第三步- 乳糖复发酵试验 报告结果,三、实验器材 1、恒温培养箱（361 ）、恒温水浴锅（461 ） 、天平、灭菌培养皿、试管。 2、培养基及试剂： 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板（EMB）、牛肉膏蛋白胨培养基,1.以1ml无菌吸管吸取样品1ml加入9ml 无菌生理盐水， 使样品（自来水、饮用水、饮料等）成 1：10 、1：100 、1：1000 等几个稀释度；样品
3、（下水道水、牛奶）稀释度要适当高。 2.分别在无菌平皿内加入1：100、1：10、原样的样品各1ml，每个稀释度均做一个平板。 注意 ：先加浓度低的样品，再加浓度高的样品 3.将冷却45的营养琼脂倾注于平皿中，摇匀，置37 培养24小时。,四、实验步骤-细菌总数测定,平皿分4部分点数（见图） 求同一稀释度的平均菌落数 如： A1数 + A2数 + A3 3,4、菌落计数：,1）平板菌落数的选择 2）稀释度的选择 3）菌落数的报告 菌落数100 按实有数报告 菌落数100 采用两位有效数，后面数值 四舍五入（也可用10的指数表示） 无法计数 无法计数报告 （ 注明水样的稀释倍数）,5. 菌落计数
4、的报告：,稀释度的选择： 1. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之 2. 若有两个稀释度其生长之菌落数均在30-300，则应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告平均数。 若其比值大于2则报告其中较小的数字。 3. 若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 5. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一 部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。 6. 若所有稀释度的菌落数均不
5、可计数，则以最高稀释倍数无法计数 报告之。,稀释度选择及细菌总数报告方法 稀释液及菌落数 10-1 10-2 10-3 1 1,365 164 20 16，400 16，000或1.6104 2 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或3.8 104 3 2,890 271 60 2.2 27，100 27，000或2.7104 4 不可计 4，650 513 513，000 510，000或5.1 105 5 27 11 5 270 270或2.7 102 6 不可计 305 12 30，500 31，000或3.1 104 7 不可计 不可计 不可计 10-3无法计数
6、,稀释 倍数,平均,菌落,数,例 次,两稀释度,菌落数之比,细菌总数,(个/g或个/ml),报告方式,(个/g或个/ml),菌落计数的报告: 菌落数 报告结果 1、 30300 之间 平均菌落数 X 稀释倍数 2、 求比值 2 取较小稀释倍数 在30300之间 300 最高稀释度平均菌落数 X 最高稀释倍数 4、 300 30 6、 无法计数 报告无法计数,取最接近的 X 稀释倍数,(若有两个稀释度),五、大肠菌群的检测 检品 胆盐乳糖发酵管 伊红美兰平板 大肠杆菌菌落纯培养 乳糖复发酵管（-） 乳糖复发酵管（）,1、检样稀释 以无菌操作将检样1mL放于含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌
7、玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。 另取1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。 根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管，每支试管接种1ml。,2. 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置361温箱内，培养24h2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按
8、下列程续进行。,3.分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361温箱内，培养18h24h，然后取出，观察菌落形态并做革兰氏染色和证实试验。 4.证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361的温箱内培养24h2h，观察产气情况。 凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性。 5.报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）食品中大肠菌群的MPN 值。,表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表,大肠菌群测定,挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落； 红色、粉红色菌落。,抑制剂：胆盐
9、、煌绿、十二烷基硫酸钠。,产酸判断：紫色培养液变成黄色,产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。,饮用水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标 指 标 细菌总数 大肠菌群 饮用水 100个/ml 3个/L 消毒牛奶 30，000个/ml 40个/100ml 瓶装汽水、果味水 及果汁类饮料,品 种, 100个/ml 5个/100ml,五、实验报告,（一）、列表记录并计算实验结果 （二）、思考题 1、怎样判断分离到的微生物是大肠杆菌？ 2、接种了微生物的培养皿为什么要倒置培养？,实验准备（2个样品/组）,培养皿：10套/组 无菌水：10支（9毫升/支） 乳糖胆盐发酵培养基：18支试管、5ml/支 100ml 伊红美蓝琼脂培养基（EMB）:100ml，4个平板 牛肉膏蛋白胨培养基:150ml，6个平板,
