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1、国家自然科学基金 标书写作分析,miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究,思路与背景介绍,心脏发育很重要 从胎儿畸形心脏-正常心脏中寻找研究线索-差异miRNA miRNA19b差异明显、生物信息学分析发现其在物种间功能保守 做实验发现： miRNA19b过表达可以导致斑马鱼心脏畸形（功能） 读心脏发育文献：影响WNT、BMP、TGFbeta是怀疑的可能机制（机制） 生物信息学分析发现： miRNA19b下游靶标是WNT1 临床标本确定：WNT是变化的、与miRNA19b关系是一致的 提出问题：究竟是不是这个机制？（主线与研究内容）,miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究,三个关键词： miR-
2、19b 、先心、Wnt （miR-19b、心脏畸形、机制）,miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究,确定有无创新,源头创新： miR-19b与先心关系未见报道 切入点： miR-19b（主要论述点）,确定科学问题,一个科学问题： miR-19b致胚胎心脏畸形的机制？ 一条主线： Wnt机制 （经典通路、研究的内容）,提取关键词,确定研究内容 一条主线下的三个层次,（一）整体验证（miR-19b与心脏畸形）及相关性评价（Wnt）： miR-19b表达异常对斑马鱼胚胎心脏发育及Wnt信号通路的影响 （二）机制分析：miRNA-19b影响Wnt信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制 1. miR-19b与
3、Wnt1过表达对斑马鱼心脏畸形的影响 2. miR-19b与Wnt1沉默表达对斑马鱼心脏畸形的影响 （三）机制验证：miR-19b对Wnt1的调控机制,故事讲述：1）先心防治现状与危害 研究的必要性、意义 2）目前有关遗传学研究进展 国内外进展，提出miRNA 3）有关miRNA与先心 找到更新的会有价值 4）miR-19b的发现 与先心关系无，创新性 5）在斑马鱼的研究结果 整体功能指标 6）信息分析其可能机制 WNT通路引出 7）临床标本+斑马鱼看WNT通路 论证其机制的可能性 8）课题拟研究思路 展现全貌 9）研究成功将带来的价值 研究价值,写作策略,标书初步写作 摘要与立项依据部分,(
4、限400字)：miRNAs 在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下一代测序和miRNA芯片筛选均发现心脏畸形流产胎儿心脏组织中miR-19b 表达异常，miR-19b 过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发现Wnt1 为miR-19b 的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中Wnt1 蛋白表达下调, Wnt 信号通路下游蛋白GSK3表达上调，提示miR-19b 可能通过影响Wnt 信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察miRNA-19b 致斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默和过表达，论证miRNA-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建miR-19b 表达
5、载体和含野生型或突变体的Wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入P19 细胞，揭示miR-19b 对Wnt1 的调控机制。研究具有源头创新性，并可能阐明miR-19b 致胚胎心脏畸形的机制，为先天性心脏病在胚胎期的早期防治提供帮助。,立项依据 脊椎动物的心脏是胚胎发育过程中最早形成并行驶功能的器官，其发生需经由多细胞系特化、管状结构形成、最后精确组装成成熟4个心腔结构等发育过程，需要一系列重要的形态发生事件，包括细胞决定、细胞迁移和细胞分化等1，其间有多条信号通路（如Wnt 信号通路、Notch 信号通路等）参与其发育调控2,3，以保证胚胎心脏形成在时间和空间的协调发育。由于心脏的
6、血液循环功能对脊椎动物的生存起关键作用，心脏发育畸形不但严重影响动物生后的宫外生活质量，而且常导致流产、死胎等4，因此有关胚胎心脏畸形的研究近年来受到普遍重视，并已成为预防医学领域疾病早期防治的一个热点研究内容。,现已知，miRNAs 参与调控胚胎心脏的发育，在心肌细胞的生长及分化过程中发挥着极其重要的作用5。已有研究报道靶向敲除特异的miRNA 与心脏畸形密切相关，其中敲除小鼠的miRNA-1-2 导致50%小鼠发生室间隔缺损而死亡, 存活小鼠解剖发现心室穿孔6；敲除miRNA-133a-1/miRNA-133a-2 的小鼠胚胎发生心脏心室壁变薄和心室发育缺陷7；在敲除斑马鱼胚胎miRNA-
7、138 的研究中，发现斑马鱼心房和心室发育异常，心肌前体细胞成熟受阻8。虽然上述与心脏畸形相关miRNAs 的研究已经取得了一些进展，但目前明确对胚胎具有心脏致畸作用的miRNAs 并不多，因而采用下一代测序或生物芯片等技术筛选与胚胎期心脏畸形相关的差异miRNAs，对其表达调控机制进行研究显得尤为重要9。,近年来，采用下一代测序或生物芯片等技术主要用于筛选模式动物（斑马鱼、小鼠）胚胎期心脏畸形相关的差异miRNAs，未见文献对心脏畸形流产胎儿心脏组织相关的差异miRNAs 的筛选研究报道5。本研究小组利用我院产前超声诊断科对孕中期胎儿进行系统超声检查的优势，收集到超声筛查并确诊的胎儿左心发育
8、不良孕妇（孕21w）3 例，家属从优生优育的角度要求流产；同时收集到未婚先孕来我院要求流产的同胎龄3 例正常胎儿的孕妇作为对照（见工作基础中图1），征得医院伦理委员会和孕妇家属的同意，对流产胎儿进行尸检并留取胎儿的心脏组织进行实验研究。我们在南方医科大学生物电子学国家重点实验室开放研究基金（miRNA 在胎儿先天性心脏病中的差异表达研究，项目号：NFYKDX2010012，2010.12011.12，在研）的资助下，同时应用下一代,测序和生物芯片技术对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织的miRNA 表达谱进行分析，结果均发现8 个miRNA 在左心发育不良流产胎儿心脏组织与正常对照之间存在3
9、倍以上的差异表达，并和real-time PCR 验证的结果一致（见工作基础中图26）。其中miRNA-19b 在进化上高度保守（见工作基础中表1）；在斑马鱼、犬、人的胚胎心脏发育早期及生后均有表达11,12；已有研究应用miRNA 芯片筛选成人扩张性心肌病人心脏组织发现miRNA-19b 表达异常的报道10；结合我们发现miRNA-19b 在孕中期左心发育不良胎儿心脏组织中表达明显上调，提示miRNA-19b在心脏发育早期起到重要的作用。我们采用体外合成miRNA-19b 前体显微注射入斑马鱼受精卵，结果发现受精后72 h 斑马鱼心脏扩大，心肌管未能环化，提示胚胎期miRNA-19b 过表达
10、可致胚胎心脏畸形（见工作基础中图7）。鉴于miRNA-19b 致胚胎心脏畸形及其机制目前未见报道，因此有必要开展在体实验研究，并深入探讨其机制。,现已知，心脏起源于中胚层，其胚胎时期的发生发育主要受Wnt 信号通路2、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路13、Notch 信号通路3等调控。其中，虽然BMP 信号通路与Notch 信号通路在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用，但均需通过Wnt 信号通路来完成心肌细胞的特化，提示Wnt 信号通路在胚胎心脏发育中的重要作用。经典的Wnt 信号通路参与调控心肌细胞命运、细胞增殖及凋亡等过程2，配体Wnt1
11、 蛋白是其激动分子，当配体蛋白与细胞表面卷曲蛋白（Frizzled）家族的七次跨膜受体结合后，能够通过激活胞质中Dsh（dishevelled）蛋白，抑制GSK3（glycogen synthase kinase 3）的磷酸激酶活性，拮抗-连环蛋白（-catenin）的降解，使其在胞质中大量聚集，并进入细胞核结合TCF/LEF 家族的转录因子，从而激活下游不同靶基因如cyclin D 等，呈现其生物学效应2。因此，经典的Wnt 信号通路中，Wnt1 是该信号通路的启动因子，GSK3是其功能的调节开关，而-catenin 则是其功能的执行者。,我们通过生物信息学对miRNA-19b 的靶基因进行
12、预测14，发现Wnt 信号通路中关键蛋白Wnt1 为其潜在靶基因，两者的互补结合序列在进化上高度保守（见工作基础中图8）；本研究小组前期对孕鼠子代心脏发育异常的实验研究中，发现孕鼠子代心脏畸形与Wnt 信号通路密切相关15，因而我们联想到是否Wnt 信号通路也在miRNA-19b 致胚胎心脏畸形中起到重要的作用。我们进一步对孕中期左心发育不良流产胎儿心脏组织中Wnt 信号通路中关键分子（Wnt1、GSK3、-catenin）的蛋白和基因水平进行研究，发现-catenin 表达下调， GSK3 表达上调，两者mRNA 和蛋白水平的变化幅度一致；而Wnt1 mRNA 表达不变，蛋白表达水平下调（见
13、工作基础中图9），提示Wnt 信号通路在miRNA-19b 致胚胎心脏畸形中起作用，Wnt1 可能和miRNA-19b 直接结合，抑制Wnt1 的翻译，但不影响其转录，这和miRNA 通过碱基配对方式结合靶基因mRNA 的3UTR，导致靶基因的翻译受抑制，但不影响其转录的特点是一致的16，但这并不能作为miRNA-19b 与Wnt1 直接作用的证据，为了确认Wnt1 是miRNA-19b 的直接靶位点，可以采用荧光素酶报告基因实验进行鉴定17。前期通过生物信息学预测发现Wnt1 启动子的一段碱基序列“UUUGCAC”和miRNA-19b上的保守序列“AAACGUG”互补结合（见工作基础中图8）
14、，这可用于进行荧光素酶报告基因实验揭示miRNA-19b 是否通过这个互补位点直接结合靶基因Wnt1，进而调控Wnt 信号通路。,鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中发挥重要作用的Wnt 信号通路为切入点，深入探讨miRNA-19b 致胚胎心脏发育畸形的机制。首先通过分析miRNA-19b 过表达或表达沉默时斑马鱼心脏发育情况（如心脏发育异常个体的百分比、心率）及对Wnt 信号通路的影响（原位杂交观察斑马鱼心肌中Wnt信号通路中相关基因Wnt1、GSK3、-catenin 的表达水平），获得miRNA-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；继而
15、分别构建Wnt1 与miRNA-19b 的过表达或沉默表达载体，通过双载体转染（“miRNA-19b 沉默+ Wnt1 过表达”或“miRNA-19b 过表达+Wnt1 沉默”） 观察斑马鱼心脏发育情况，论证miRNA-19b影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建miRNA-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入中胚层来源的P19 细胞，通过检测荧光素酶的活性及Wnt 信号通路中关键分子Wnt1、GSK3、-catenin 的基因和蛋白表达水平的变化，揭示miRNA-19b 对Wnt1 的调控机制。由于miRNA-19b 致胚
16、胎心脏畸形及其机制研究目前未见报道，本研究具有源头创新性。研究若成功，将为阐明miRNA-19b 致胚胎心脏畸形的机制提供新的线索，为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据。,写作点评,miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究,(限400字)：miRNAs 在胚胎心脏发育中发挥着重要的作用。前期应用下一代测序和miRNA芯片筛选均发现心脏畸形流产胎儿心脏组织中miR-19b 表达异常，miR-19b 过表达可致斑马鱼心脏发育畸形；生物信息学分析发现Wnt1 为miR-19b 的靶基因，在心脏畸形流产胎儿心脏组织中Wnt1 蛋白表达下调, Wnt 信号通路下游蛋白GSK3表达上调，提示miR-19b 可能通过影响Wnt 信号通路致胚胎心脏畸形。本研究拟在体观察miRNA-19b 致斑马鱼胚胎心脏畸形；应用基因沉默
