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1、烟草基因组中NBS类抗性基因的分析,专 业 作 物 学 答 辩 人 冷 晓 东 指导教师 樊龙江教授,综 述,烟草是一种重要的经济作物，烟草行业一方面能够为国家增加税收，同时对发展国民经济和满足人民生活需要，都起了重大的作用。 烟草作为模式植物，对于植物科学发展来说，无论是在基础研究还是在应用方面都起了很大作用，尤其是在遗传、育种、生理、生化以及采收后代谢方面。 烟草也是研究植物病原互作最好的模式作物之一。抗性基因在植物与病原互作过程中，起到非常重要的作用。所以对抗性基因的研究，无论对植物本身，还是对指导育种都有非常重要的意义。 在烟草基因组测序的背景下，我们对烟草抗性基因进行了一些基础性的研
2、究。,研究过程,烟草基因组的分析 (基于TGI基因组序列) NBS类抗性基因的 生物信息学分析 烟草NBS类抗性基因 遗传多态性分析 NBS类抗性 与抗性基因连锁的 基因家族分析 SSR分子标记的开发,关于TGI（Tobacco Genome Initiative http:/tgi.ncsu.edu/）,拼接去冗余后信息,RGA（ Reistance gene analogue）的背景介绍,I,II,III,IV,V,PK,NBS,LRR,LZ/CC,TIR,TM,PK,Pto,Mi/Prf,Xa21,Cf4/Cf9,N,NBS,LRR,LRR,LRR,TM,Representative g
3、ene,分析流程,已知的NBS抗 性基因,同源序列搜索,清理 拼接,基因预测,蛋白预测,寻找结构域,系统发育树,已知的NBS类抗性基因,烟草基因组中鉴定出的NBS类基因结果统计,烟草基因组中30个NBS类基因的分类,烟草和其他植物间NBS类基因的系统发育关系,蓝色，绿色，紫色和黄色分别代表烟草，拟南芥，番茄和杨树,实验部分,PCR扩增产物,直接测序,克隆测序,遗传多态性分析,基因家族系统进化分析,30对引物24个材料,本研究使用的烟草材料,注：抗性等信息来自中国作物种质信息网（）,引物设计位点,植物抗性基因结构和本研究引物设计位点。图中标出了NBS功能域三个主要基序和C-和N-端通常具有的功能
4、域，箭头为本研究引物设计位点,本研究设计的30对烟草RGA引物,PCR产物直接测序鉴定的烟草RGA基因,得到如下遗传多态性分析结论： 1、栽培与野生烟草之间存在明显的遗传多态性,栽培烟草与其野生祖先种（N.sylvestris）之间的分子多态性,注：括号中为累计长度（bp）,2、栽培烟草RGA基因的遗传多态性表现出极端的同质性,克隆测序鉴定的烟草RGA基因家族,HHDJY:红花大金元,烟草RGA基因亚家族的遗传分化与进化,1 遗传分化分析 对11个RGA家族内成员遗传分化程度进行了分析：对这些 RGA基因家族成员分别进行建系统进化树，根据树型，有些树分化程度明显较大（如NBS334），表明这些
5、亚家族内部分化明显。,A,B,C,D,E,F,G,H,基于RGA核苷酸序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因4个亚家族的系统进化树。A: NBS226; B: NBS173; C: NBS271; D: NBS374; E: Nbs359; F: NBS182; G: NBS334; H: NBS267,2 进化分析 进一步对RGA亚家族选择进化进行分析。RGA基因进化历程可能是处于一种中性随机突变状况（M1a和M7模型）或受到正向或负向（又称净化）的选择（M2a和M8模型）。根据Yang等（2005）方法(Yang et al., 2005)，我们可以估计烟草RGA基因亚家族成员的序列构成
6、符合哪个进化模式。结果表明 在测验的8个RGA基因中，大多受到强烈的净化选择，同时部分基因在其个别位点上受到明显的正向选择。,烟草RGA基因亚家族进化选择测验（似然比）结果,考虑到测序等误差，所选用的每个RGA亚家族成员间序列差异度1% (Couch et al., 2006),烟草基因组RGA基因的系统进化关系,通过PCR产物直接测序和克隆测序，共获得426条特异RGA基因序列，包括来自栽培烟草11个RGA家族的293条基因序列和19条野生烟草的基因序列。经注释，除了部分由于移码、终止子等导致的假基因，其中绝大多数序列可以获得完整的NBS蛋白质序列。为了确定这些基因序列的系统进化关系和亚家族
7、归属，我们对获得的所有序列和已知烟草和其他主要类型抗性基因进行了系统进化分析。从系统进化树可以看出，我们鉴定的烟草RGA几乎覆盖了所以类型的已知抗性类型，包括TIR-NBS类和大量非TIR-NBS类基因。非TIR-NBS类基因中，烟草中一个烟草亚家族（I2，红色部分）已进行一定数量的测序调查(Couch et al., 2006)，我们获得的数据也同样包含了这类RGA基因序列。同时，与已知抗性基因有较大差异的一批烟草RGA被发现，这部分RGA基因表现出烟草RGA的特异性，其中部分可能是烟草特有的RGA。,基于RGA蛋白质序列和临接法（NJ）构建的烟草RGA基因系统进化树,图中包括本研究获得的烟
8、草NBS类抗性基因（黑色）、GeneBank数据库中已有烟草RGA基因序列（红色）和目前已克隆抗性基因（其他颜色）。,烟草RGA类抗性基因SSR分子标记开发,前期对烟草RGA基因进行了基因组分析，发现了一大批烟草RGA基因，遗传多态性分析结果表明，烟草RGA基因存在高度的遗传同质化，这给发现与抗性相关RGA增加了难度。 为了探索获得与抗性相关RGA或相应标记的高效途径，本研究利用烟草基因组序列开发了与RGA紧密连锁的SSR标记。,分子标记开发流程,在基因组中查找含有RGA区段的序列,在其上下游寻找SSR序列,设计引物,23个烟草材料中进行PCR扩增,用于开发烟草SSR标记的23个栽培烟草品种及其野生种基本信息,注：黑：黑茎病；青：青枯病；根：根结线虫病；CMV:烟草花叶病毒病；蚜：烟蚜； -：感病；-：中感；-：高感。+：抗病；+：中抗。O：耐病。,开发烟草中与RGA相关的SSR标记设计的引物,开发的与RGA基因相关的SSR标记列表,讨论： 1、实验结果表明，在设计的43对引物中，能够用于 分子标记的引物有8对，NBS连锁的SSR标记的开发 效率达到近20%,是一种开发抗性基因分子标记的 有效途径。 2、由于烟草抗性基因极端同质化，作为与抗性基因 连锁的分子标记,对研究烟草抗性基因的多态性提 供新了的途径。,致 谢 ！,
