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1、,双向电泳培训,主要内容,双向电泳培训实验内容 1.样品制备及试剂准备 2.第一向等电聚焦原理及操作 3.第二向SDS-PAGE实验前准备试剂配制及制胶 4.第一向等电聚焦后胶条的处理-平衡及转移 5.第二向SDS-PAGE原理及操作 6.染色及成像,双向电泳培训前期准备工作内容,1.培训使用主要仪器,双向电泳培训前期准备工作内容,2.培训使用主要耗材,双向电泳培训实验内容,一.样品制备及试剂准备 1. 从冰箱中取出4保存的双向电泳启动试剂盒。 2. 在上样缓冲液干粉瓶中加入6.1ml去离子水，使之溶解。 3. 吸取2ml溶解后缓冲液，加入到E.coli蛋白样品瓶中，制成浓度为1.35mg/m
2、l的蛋白质样品。,双向电泳培训实验内容,二.第一向等电聚焦原理及操作 1. 原理 在第一向分离中蛋白质先按其等电点（isoelectric point pI值）分开。pI值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦（IEF）。,Carboxylic Groups Acidic pH R-COO- + H+ = R-COOH Basic pH R-COOH + OH- = R-COO- + H2O Amino Groups Acidic pH R-NH2 + H+ = R-NH3+ Basic pH R-NH3+ + OH- = R-N
3、H2 + H2O,Isoelectric Focusing,原理,等电点（isoelectric point）:在某一pH时，蛋白质的净电荷为零。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象,The 1st D: Isoelectric Focusing,双向电泳培训实验内容,二.第一向等电聚焦原理及操作 2. 操作-双向电泳上样 A. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。 B. 胶条长度加样体积样品蛋白量7 cm:125 ul(169 ug), 11 cm:185 ul(250
4、 ug), 17 cm:300 ul(405 ug)-考马氏亮蓝R-250染色 C. 取出-20冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温中放置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。 D将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。,双向电泳上样,水化上样操作,二.第一向等电聚焦原理及操作,2. 操作-双向电泳上样 E. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。 F. 对
5、好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。,二.第一向等电聚焦原理及操作,等电聚焦程序 7cm胶条 水化12小时（18）主动水化（50V）或被动水化 S1250V线性30分钟除盐 S2500V快速30分钟除盐 S34000V线性3小时升压 S44000V快速20,000伏小时 聚焦 S5500V快速任意时间保持,二.第一向等电聚焦原理及操作,等电聚焦程序 11cm胶条 水化12小时（20）主动水化（50V）或被动水化 S1250V线性30分钟除盐 S21000V快速30分钟除盐 S38000V线性4小时升压 S48000V快速40,000伏小时 聚焦 S5500V快
6、速任意时间保持,二.第一向等电聚焦原理及操作,等电聚焦程序 17cm胶条 水化12小时（20）主动水化（50V）或被动水化 S1250V线性30分钟除盐 S21000V快速1小时除盐 S310000V线性5小时升压 S410000V快速60,000伏小时 聚焦 S5500V快速任意时间保持,双向电泳培训实验内容,3.第二向SDS-PAGE实验前准备试剂配制及制胶 A. 试剂准备 161-0157 30% Acrylamide/Bis Solution, 29:1, 2500ml预混合制胶液 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0801 TEMED, 5
7、0 ml 161-0700 Ammonium Persulfate, 10 g 161-0798 Resolving gel buffer, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 1 L 161-0416 SDS Solution, 10 % (w/v ), 250 ml,B. 仪器组装,C. 制胶,配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配12ml凝胶溶液，每块凝胶6ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间，用MilliQ水或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合45分钟。(7cm胶条) 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。,C. 制胶
8、,Degas before polymerization * The letter A designates the volume of 30% Acrylamide/Bis Solution required to produce the specified percent gel (X%).,4.第一向等电聚焦后胶条的处理-平衡及转移,平衡 防止二硫键重新形成 最大程度地减少拖尾现象和蛋白点的漂移 能得到更好的重复性 蛋白被SDS包被 平衡buffer 1-2% DTT 还原(将SS键转化为SH) 平衡buffer 2-2.5%碘乙酰胺 烷基化物 (使每个SH均烷基化以防止SS 键的重新形
9、成),平衡操作,1. 配制胶条平衡缓冲液I: 在平衡缓冲液I干粉中加入13.35ml 30%的甘油，瓶内有搅拌子, 可置于磁力搅拌器上充分混匀。 2. 配制胶条平衡缓冲液II ，向平衡缓冲液II中加入碘乙酰胺，并加入13.35ml 30%的甘油，瓶内有搅拌子, 可置于磁力搅拌器上充分混匀。 2在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 3. 将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入根据胶条长度加入平衡缓冲液I。将样品水化盘放在
10、水平摇床上平衡15分钟。加样量见下表:,平衡操作,4. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 5. 再加入胶条平衡缓冲液II，将胶条胶面朝上转移至加有平衡缓冲液II的溶涨盘中, 继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 6. 第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II 。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。 7.将IPG胶条从样品水化盘中移出，并完全浸末在1电泳缓冲液中。,转移,1. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方
11、玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。 2. 将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。(中火1分钟左右) 3.将10电泳缓冲液稀释成1电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。 4. 将IPG胶条从1电泳缓冲液中移出，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。 5. 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。 6. 用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，不要在胶条下方产生气泡。 7. 而后在IPG胶条上注入加热溶解好的低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。,5. 第二向
12、SDS-PAGE原理及操作,原理,SDS-PAGE,Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS PAGE 蛋白质分子的解聚 SDS-断裂分子内和分子间氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构 DTT 断裂半胱氨酸残基之间的二硫键 分子解聚成多肽链 解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束 所带负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异 样品经离子去污剂和强还原剂处理后，蛋白亚基在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因
13、素可以被忽略,电荷,分子量,2-D 理论,蛋白会根据分子量大小以不同速率在胶内迁移. 分子量最小的蛋白会迁移至最远端.,电泳,1. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源， 第一种程序为起始时低电流（5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条，再加大电流至（15-20mA/gel/7cm） 第二种程序为开始时80V约5分钟，以后200V，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 2. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。,6.染色及成像,Bio-Safe 胶体考马斯兰是一种预制的染色溶液，它的敏感度介于Coomassie Blue R-250和银染之间。 1. 用去
14、离子水清洗凝胶三次，每次10分钟，以去除SDS。 2. 加入足够的Bio-Safe Coomassie stain覆盖凝胶，摇荡1小时至过夜。1小时后颜色会逐渐加深。 3. 在摇荡下用去离子水清洗凝胶，直到得到理想的对比度。,6.染色及成像,以GS800为例，简要说明凝胶图像扫描 过程： 1. 先开启扫描仪，再开计算机。 2. 将凝胶置于扫描仪上，用纯水小心润湿 3. 胶与扫描仪仪玻璃板之间，使之没有气泡。并用滤纸小心吸干凝胶周围的水分。 盖上上盖，准备进行扫描 进行预扫(Prescan)，确定扫描范围 调整扫描窗口大小,6.染色及成像,进行扫描,并保存扫描图像文件,结果,见下图,后续操作,用PDQuest二维分析软件对电泳图谱进行分析, 找出差异蛋白(另有课程进行) 答疑,谢谢! Thanks for your attention,
