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1、青海半细毛羊血液蛋白多态性及其与7项血清生化指标间的相关性分析 摘要采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法研究了29只青海半细毛羊的HB、ES、AMY1、AMY2及TF 5个蛋白基因位点的多态性及其与7项血清生化指标间的相关性，并计算和分析了青海半细毛羊的遗传变异系数。结果表明：被检青海半细毛羊血液蛋白的5个基因位点上，除AMY1呈现单态外，其余均存在多态性。遗传变异系数中，平均基因均质度、平均基因杂合度、平均有效等位基因数分别为0.5248 、0.4004和2.1507。青海半细毛羊血液蛋白多态性与7项血清生化指标间均无相关性（P0.05)。 关键词:青海半细毛羊，蛋白多态性，遗传变异系数，血清生
2、化指标CORRELATION BETWEEN POLYMORPHISM OF BLOOD PROTEIN AND 7 SERUM BIOCHEMICAL PARAMETERS IN QINGHAI SEMIFINE-WOOL SHEEPABSTRACT 29 Qinghai semifine-wool sheep were used to investigate the polymorphism of 5 protein gene locis including HB,ES,AMY1,AMY2 and TF by means of vertical polyacrylamide gel ele
3、ctrophoresis,and analyze the correlation between them and 7 serum biochemical parameters,and the cofficient of genetic variation was calculated.the results showed that: 4 blood protein locis are polymorphic,except that AMY1 showed a single state. the average gene homogeneity index is 0.5248,the aver
4、age gene heterozygosity is 0.4006 and effective number of alleles. There is no correlation between the blood protein polymorphism and 7 serum biochemical parameters in qinghai semifine-wool sheep. Keyword Qinghai semifine-wool sheep, protein gene polymorphism, cofficient of genetic variation ,serum
5、biochemical parameters目录绪论11 材料与方法21.1试验动物21.2血样采集21.3 测定项目及方法21.3.1 血液蛋白多态性的测定和判型21.3.2 血液生化指标的测定31.4数据处理31.4.1数据统计31.4.2 计算基因频率和遗传变异系数32 结果42.1 青海半细毛羊血液蛋白多态性42.1.1 HB型42.1.2 ES型42.1.3 AMY型42.1.4 TF型52.2 基因型频率、基因频率和遗传变异系数62.3平均遗传变异系数62.4 血清生化指标73 讨论73.1 青海半细毛羊血液蛋白多态性特征73.1.2 血红蛋白多态性83.3 不同蛋白多态性与7项血
6、清生化指标间的相关性分析84参考文献11致谢13Error! No text of specified style in document.绪论自Smithies(1955)创造淀粉凝胶电泳法以来，国内外学者用电泳方法对不同畜禽品种的血液蛋白、酶、乳蛋白、卵蛋白、精清蛋白等的多态性及其遗传机制进行了大量深入研究，这些研究大多用于确定品种间的差异程度，估计品种间亲缘关系，考证品种的起源、进化和驯化过程，或根据血浆蛋白位点的基因纯合度分析群体的近交程度，或利用血浆蛋白多态性作为遗传标记探讨早期选种的可能性。青海半细毛羊是青海省培育的品种绵羊，具有对高原低氧环境适应性好，繁殖性能高，产毛量高，生长发
7、育快，肉用性能好等优点，深受牧民们喜爱。有关青海半细毛羊的血液蛋白多态性以及血清生化指标测定的研究报道较多，贺晓龙1采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法对48只青海半细毛羊血清芳基酯酶多态性及其与血清蛋白质指标间的联系进行了研究；郭朝辉等2对海北州海晏县91只青海半细毛羊的血红蛋白多态性进行了研究；张寿等3对青海河卡种羊场的青海半细毛羊妊娠期外周血液中孕酮和雌二醇含量、马森4对青海半细毛羊血清NOS、NO、LDH、SOD、GSH-Px、MDA进行了测定。研究多为单一的血液蛋白多态性或某几项血清生化指标或某一两个指标与单一血液蛋白多态性间的相关性分析，且存在着很大的分歧。鉴此，笔者对青海半细毛羊的血
8、液蛋白多态性及其与7项血清生化指标进行了相关性分析，以期为青海半细毛羊种质资源、亲缘关系以及品种选育和改良等方面的研究提供基础实验资料。1 材料与方法1.1试验动物系青海省海晏县哈勒景乡牧民自繁的成年青海半细毛羊，共29只，皆临床健康，试验羊终年放牧饲养，冬季给予适量的草料补饲，试验动物生活地的海拔高度为29003400m。1.2血样采集 出牧前从试验羊颈静脉采取非抗凝血和肝素钠抗凝血各5ml，抗凝血样做血红蛋白电泳，非抗凝血样迅速分离出血清供血清ES、AMY1、AMY2以及TF电泳以及7项血清生化指标的测定。1.3 测定项目及方法1.3.1 血液蛋白多态性的测定和判型1.3.1.1 HB电泳
9、和分型 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳(PAGE)法进行HB变异体的分离，按张才骏等5,6介绍的方法进行，电泳时分离胶浓度为70g/l，以pH 8.9 1.5 mol/l Tris-Hcl缓冲液配制；浓缩胶浓度为35g/l，以pH 6.7 0.5mol/l的Tris-Hcl缓冲液配制；电极缓冲液为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲系统。电泳时起始电流强度为20mA，15min后调到25mA，稳流电泳3h。分型标准判型参考佐佐木清纲7的研究记载。1.3.1.2 ES电泳和分型 采用聚丙烯酰胺凝胶（PAG）垂直平板电泳法进行ES表型分析。按贺晓龙1记载的方法进行，电泳时分离胶浓度为63g/L，用p
10、H 8.9的Tris-HCl缓冲液配制,浓缩胶浓度为35g/L，用pH 6.7的Tris-HCl缓冲液配制，电泳槽内采用pH 9.0硼酸硼砂缓冲液，电泳起始电流为15 mA，15 min后增至 25 mA，稳流电泳23 h。按Tucker等（转引自铃木正三，1991）8提出的标准进行ES表型判定，即以-乙酸萘酯为基质，37孵育15min内出现紫褐色酶活性区带者判定为ESA型，不出现酶活性区带者判定为ESa型。1.3.1.3 AMY电泳和分型 按胡能书等9记载的聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法分离所有实验羊的AMY同工酶酶谱，同一样本进行两次电泳，分别用加钙和不加钙的两种pH 5.0,0.15mmo
11、l/L的醋酸-醋酸钠缓冲液孵育。AMY同工酶谱分析根据区带泳动速度、酶活性显现与否、钙离子的影响，参考张才骏等10，11的记载命名AMY同工酶、判定表型和分析酶谱。1.3.1.4 TF电泳和分型 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法，按张才骏12记载的方法进行，分离胶 Tris-HCl pH 8.9，凝胶浓度7.5%，聚合1h以上，浓缩胶TrisHCl pH 6.8，凝胶浓度3.5%，聚合0.5h以上，以0.03%溴酚兰做指示剂，缓冲液为pH 8.3的Tris-甘氨酸，开始时电泳电压为80V，待样品进入浓缩胶后，电压升至120V，将电泳槽移入冰箱，至指示剂距胶板下端1.0-1.5 cm时停止电泳。剥
12、下胶片，置7%乙酸2%甘油溶液中固定20 min，转入0.25%考马斯亮蓝染色30min，然后置7%乙酸溶液脱色，不断更换脱色液，直到背景清晰为止。参照铃木正三13标准进行判型。1.3.2 血液生化指标的测定血清碱性磷酸酶（AKP）活性：采用磷酸苯二钠比色法；血清总胆固醇（CHO）和血清甘油三酯（TG）含量：采用酶法；血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和血清低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）含量：采用选择性沉淀法；血清谷丙转氨酶（ALT）和血清谷草转氨酶（AST）活性：采用赖氏法。以上所用的测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,批号均为20090603。所有比色项目均在721分光光度计（厦门分析
13、仪皿厂制造）上进行测定。1.4数据处理1.4.1数据统计 青海半细毛羊7项血清生化指标均采用SPSS 13.0统计软件处理，以平均值（）标准差（SD）表示。不同血液蛋白基因型间的7项血液生化指标的差异显著性用t检验统计分析。1.4.2 计算基因频率和遗传变异系数 青海半细毛羊5个蛋白基因位点上，根据HB、TF电泳变异体受共显性等位基因控制的假设和ES、AMY1、AMY2电泳变异体受显隐性等位基因控制的假设，由所显示的电泳表型直接推断基因型，计算基因频率。基因杂合度按公式H =计算式中Pi为某一位点第i个等位基因频率。基因均质度指数按公式HI=（n/n-1）(P21+P22+P2n)-1/n 计
14、算式中n为等位基因数，P1，P2，Pn为基因频率。有效等位基因数按公式 =式中Pi为某一位点第i个等位基因频率。2 结果2.1 青海半细毛羊血液蛋白多态性2.1.1 HB型青海半细毛羊的红细胞溶血液经PAGE，均分离出HBA和HBB两种变异体，构成HBAA、HBAB和HBBB三种基因型(见图1)。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29图1 青海半细毛羊HB电泳图谱2.1.2 ES型 青海半细毛羊ES基因位点上由ESA和ESa等位基因控制，存在ESA和ESa两种表型而呈现多态性（见图2）。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 25 26 27 28 29图2青海半细毛羊ES 电泳图谱2.1.3 AMY型 被检羊的血清经电泳分离出AMY1，AMY2和AMY3三种表型，即AMY1的泳动速度最快，全部试验羊都显现一条酶活性区带(见图3)；AMY2在没有钙离子的孵育液中不显现酶活性，在含有钙离子的孵育液中，8只实验羊显现酶活性区带，而其余21只不显现酶活性(见图4)；AMY3同工酶位于电泳起始部。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1
