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1、第九章园艺植物遗传转化载体的构建,主要内容,根癌农杆菌Ti质粒基因转载体的构建发根农杆菌Ri质粒基因转化载体的构建载体构建中常用的选择标记基因和报告基的因园艺植物常用的遗传转化载体类型目的基因与载体的连接,根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。,农杆菌属（Agrobacterium）有2种重要植物病原菌,根癌农杆菌（Agrobacteriumtumerfaciens)携带有Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）,发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenesis）携带有Ri质粒(Root-inducingplasmid),在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒(大肠杆菌
2、质粒，农杆菌质粒)和植物病毒作为载体。其中以根癌农杆菌Ti质粒转化载体是最为重要，是本章重点介绍的内容。,冠瘿瘤病(根癌病)症状1、植物根及茎基部产生2、最初原因是受伤后引起,alfalfa,根癌农杆菌（Agrobacteriumtumerfaciens）,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,Ti质粒的发现历史1974年zeazen等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒，称为致癌质粒（Tumorinducingplasmid）,简称Ti质粒.最初的发现和命名是1907年,Smith和Townsent发现双子叶植物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)
3、诱发形成的.,Ti质粒的遗传特性及类型,Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为9.51071.6108，大小为180250kb。迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它们的Ti质粒结构特性均有差别。根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。,Ti质粒的基因位点及其功能区域,Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁
4、香酮及其衍生物的结构示意图（右）（1）T-DNA区（transferred-DNAregions）:T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。（2）Vir区（virulenceregion）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH7个操纵子共24个基因。（3）Con区（regionsencodingconjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）
5、,调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。（4）Ori区（originofreplication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。,LB,RB,Ti质粒介导基因转化的原理,1.植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、-羟基乙酰丁香酮等)。2.酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表达:当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIRA蛋白传递给VIRG，VIRG激活其它vir基因(virB、virC、virD、virE)表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。3.T-DN
6、A单链分子释放：virD基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB)切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链形式释放出来。4.T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与vir产物VIRD2蛋白共价结合，并在VIRD4和VIRB蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。,Ti质粒介导基因转化的原理,5.T-DNA整合到植物细胞的染色体中。T-DNA单链分子进入植物细胞后，在植物有关酶体系的催化下，互补的双链T-DNA分子,在RB序列的引导下，T-DNA分子整合到植物细胞的染色体中。6.T-D
7、NA区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值，形成冠瘿瘤，随着转化细胞的增值，T-DNA也被大量扩增，冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加，这些基因表达后催化合成冠瘿碱，为农杆菌的生长提供碳源和氮源。,信号受体（VIRA）,酚类物质诱导信号,VIRG,RB,LB,转移到寄主细胞,整合到植物染色体中,T-DNA单链分子释放,VIRG激活virB、virC、virD、virE、virH表达,VIRD,植物伤口,诱导信号,信号传递,诱导表达,VIRD2、VIRD4、VIRB、VIRE2等,土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制,酚类物质,VIRA,由此可见，农杆菌对植物的侵染作用，就是一种
8、天然发生的基因工程。,一、Ti质粒的改造(一)Ti质粒1.定义是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状DNA大分子，其大小为180-240kb。2.种类2.1根据冠瘿碱的种类不同章鱼碱型(octopine);胭脂碱型(nopaline);农杆碱型(agropine)和农杆菌素碱型(agrocinopine)or琥珀碱型(succinamopine),第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(一)Ti质粒2.种类2.2根据功能区段不同基因转移T-DNA区(transferredDNAregion)：与基因转移相关毒性区,即Vir区(Vi
9、rulenceregion,Vir):激活T-DNA转移,使农杆菌对植物表现出侵染性的毒性区接合转移区(regionencodingconjuation,Con)调控Ti质粒在农杆菌间发生接合转移自我复制区(originofreplication,Ori)调控Ti质粒自我复制,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(二)天然Ti质粒存在的缺点1.缺点野生型Ti质粒分子十分巨大；野生型Ti质粒分子一般都为180-240kb,几乎无法进行基因工程的操作，所以应去除一切不必要的大片段DNA。限制性内切核酸酶位点众多；Ti质粒是分布着各种限制性内切核酸酶，难以找到可利用的单一限制性内切核酸酶位，
10、因此很难通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因.T-DNA区段内含有许多编码基因；植物生长素合成酶基因,细胞分裂素合成有关酶基因等.在大肠杆菌中不能复制。,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(二)天然Ti质粒存在的缺点2.改造删除T-DNA左右边界中的tms、tmr和tmt基因,即切除T-DNA中onc基因,构建所谓的“卸甲载体”；引入大肠杆菌的复制起点和选择标记基因,或将Ti质粒的T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒当中,形成植物基因转化载体系统,从而使通过Ti质粒的基因重组成为可能并有利于转基因植物的筛选；插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆和操作；,第一节根癌
11、农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,引入植物基因的启动子和poly(A)信号序列，以确保外源基因在植物细胞内能正确高效地转录表达；除去Ti质粒上的其他非必需序列，以最大限度地缩短载体的长度。研究表明,大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性,因此,可以先将T-DNA的片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把外源基因引入到农杆菌的Ti质粒上.中间载体:带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体;受体Ti质粒:接受中间载体的Ti质粒.,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,(三)御甲载体定义:无毒的(non-oncogenic)Ti质粒载体,又称onc-载体。野生型Ti质
12、粒中T-DNA中onc基因具有致瘤作用，因此,作为基因转化的载体，必须切除T-DNA中的onc基因，即解除其武装，构建成卸甲载体。在onc-卸甲载体中，已经缺失的T-DNA部位通常被大肠杆菌中的一种常用质粒pBR322取代.这样任何适于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段,都可通过pBR322质粒DNA与卸甲载体的同源重组而被共整合到onc-Ti质粒载体上.,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,二、Ti中间表达载体的构建中间载体定义:是指在一个普通大肠杆菌的克隆载体中插入了一段合适的T-DNA片段面构成的小型质粒。中间载体从功能上可分为两大类:1.克隆载体:复制和扩增基因2.表达载
13、体:适于在受体细胞中表达外源基因的载体Ti中间表达载体结构区包括:选择标记基因区域;目的基因区域每个区域由启动子、基因和终止序列组成.,二、Ti中间表达载体的构建(一)启动子及调控序列经由Ti质粒将外源基因整合到植物中并不一定就会发生基因的转录与表达，其先决条件在于必须要有合适的启动子和调控序列。真核生物基因调控序列中，大多数都具有“TATA”框，位于距离转录起始点约30个核苷酸的上游区域，上游DNA的序列成分如“CAAT”(在上游-80-70bp处)也普遍存在于许多真核生物基因的启动子中。真核生物基因的3端具有AATAAA序列，从而使基因在转录过程中可以在mRNA的3端增加poly(A)的信
14、号。,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,由AATAAA编码的mRNA序列AAUAAA的作用是发出信号，让核酸酶在此序列下游10-15bp处切割mRNA,以便poly(A)聚合酶在切割点的3端加上100-200个腺苷酸.其作用是使mRNA的3端结合到内质网膜上,从而使3端稳定,起到保护mRNA的作用.CaMV35S启动子Ubiquitin启动子,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,二、Ti中间表达载体的构建(二)嵌合基因的构建嵌合基因:来自两种或两种以上生物的启动子,结构基因连接在一起而构成的基因.完整的嵌合基因:完整,正确的可读框,
15、能正确表达,3端的终止信号.“植物特异性启动子+目的基因+终止子”、“植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和“植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。,三、Ti共整合转化载体的构建共整合载体定义指中间载体与改造后的受体Ti质粒之间,通过同源重组所产生的一种复合型载体.(一)Ti共整合载体的特点Ti共整合载体由两个质粒组成,其中一个是E.coli质粒中间载体,另一个是御甲Ti质粒组成.农杆菌中两个质粒形成一个大的共整合载体.共合体的形成频率与两个质粒的重组频率有关,相对较低.必须用Southern杂交或PCR对大的共整合体质粒进行检测构建是比较困难.,第一节根癌农杆菌Ti质粒
16、基因转化载体的构建,三、Ti共整合转化载体的构建(二)Ti共整合转化载体的类型和构建策略基于中间载体与受体Ti质粒重组序列的不同,共整合载体可分为以pBR322序列为同源序列的转化载体系统和基于左边界内部同源区(LIH)的转化载体系统,即SEV系统.1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略此类载体系统的典型特点是在卸甲质粒的T-DNA区引入了pBR322,而中间载体是pBR322质粒或衍生质粒,二者之间通过同源重组实现目的基因及选择标记基因与卸甲Ti质粒的整合,进而以顺式方式将基因转化到植物细胞中去.,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,1.基于pBR322同源序列的共整合载体的构建策略中间载体导入农杆菌pBR322及由其衍生的质粒为接合缺陷型,所以它们进入到农杆菌菌株中必须要有协助质粒,在协助质粒的动员下转移到农杆菌中.三亲杂交法:即将分别含有中间表达载体,协助质粒,受体质粒的菌液混合培养,在混合培养过程中,通过杂交使协助质粒先转移到含有重组中间载体的菌株中,然后中间载体再被动员和转移到农杆菌中.,第一节根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建,
