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1、器械的清洗,2011.10.11,为何要进行清洗？,离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，这些物质包括微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质。除一次性用品外，玻璃、塑料、橡胶和金属质地等其他培养用品，无论新旧，使用前均需彻底清洗。,ExperimentofCellEngineering,玻璃器皿的清洗,刷洗,浸泡,浸酸,冲洗,玻璃器皿的清洗,1主要包含有：培养瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，离心管，试管，培养皿等。,清洗标准：,玻璃透亮，内外壁水膜均匀、无油迹，无任何残留物质。,塑料、橡胶类器皿的清洗,1塑料类器皿主要包括：孔板、大枪头、瓶盖、滤器、超声管、注射器等。2橡胶类器皿主要包括：乳
2、胶头、橡胶头、胶塞、胶垫等。,2清洗步骤：,泡在有洗洁净的自来水中用毛刷或者纱布将各个面刷洗至少25遍自来水冲洗25次以上过一遍一蒸水泡入盐酸过夜从酸中捞出后自来水冲洗25遍过三遍一蒸水，三遍三蒸水烘箱内烘干收入柜子用前高温灭菌（121，20min）烘干使用注意:乳胶类器材由于常有滑石粉类成分，故应先用流水充分清洗。,目录,细胞培养基本概念细胞培养基本要求细胞培养基本技术,细胞培养定义,定义：模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。优点：1活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2可控制：各种物理、化学、生物
3、等因素可调控；3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4应用广：不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）；缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。,细胞培养的基本概念,传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,接触抑制（Contactinhibition）,细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化的细胞却可以继续生长导致细胞重
4、叠堆积生长。,体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick极限”。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。,细胞传代次数（PassageNumber）,原代培养（primaryculture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。,克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,细胞系（ce
5、llline）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖,细胞株（cellstrain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。,原代培养与细胞系,原代培养细胞的生命归宿,原代培养期传代期衰退期,TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA
6、,细胞系资源,有限细胞系，无限细胞系细胞系cellline细胞株cellstrain,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基
7、质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性,二、细胞培养基本要求,常用仪器设备培养器皿培养基血清其他细胞培养试剂,培养细胞生长的条件,1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37O2CO2:5%CO2+H2OH2CO3H+HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒,常用仪
8、器设备,超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成
9、无菌环境。,滤器,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h)。箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器纯水仪,酶标仪微孔板震荡器,Cultureflask,CulturePlate,培养器皿,浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,常用玻璃器皿清洗,清洁液的配制,细胞培养基,干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配
10、制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等,培养基的选择,没有一定的标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,血清使用注意事项,
11、血清必须贮存于20-70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。血清解冻步骤(逐步解冻法):-20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。热灭活（heat-inactivation）是指56,30分钟加热已完全解冻之血清。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非
12、必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质,凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多
13、。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。,血清沉淀物,如何避免沉淀物的产生?,解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中
14、许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。,谷氨酰胺,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内使用终浓度为1-4mM一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/
15、L）配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM,酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH指示红色表示中性pH黄色代表酸性pH紫色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml,细胞培养用液
16、的配制,抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定,完全培养基的组成,基础培养基80一95血清5一20碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位毫升,培养基的配制,RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2加血清（终浓度10）,细胞消化液,分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用EDTA4Na溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长,三、细胞培养基本技术,细胞原代培养细胞换液与传代细胞冻存与复苏,鼠
