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1、外泌体外泌体最新最新研究研究进展进展 成像成像流式的新发现流式的新发现 外泌体是一种直径为 30-100nm 的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA 和 microRNA 等物 质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在 血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明，宿主细胞 或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、 生长、侵袭和转移。免疫细胞和肿瘤细胞之间通过外泌体进行信 息交换，这种通讯方式在调节肿瘤免疫中发挥了双重作用。外泌体既可以通过抑制免疫细胞（DCs、NK 细 胞、 CD4+ 和 C
2、D8+ T 细胞等） 引发的抗肿瘤反应， 以及诱导免疫抑制或调节细胞群 （MDSCs、 Tregs 和 Bregs） 的免疫抑制。 外泌体外泌体产生产生过程过程的示意图的示意图： Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles Emanuele Cocucci and Jacopo Meldolesi, Trends in Cell Biology, June 2015. Vol. 25. No.6 过去研究外泌体的主要工具包括 Nanosight、Apogee、confocal 和传统
3、流式细胞仪。这几种工具各有优 点， 也都具有其局限性， 如 Nanosight、 Apogee 和传统流式细胞仪只能检测外泌体颗粒， 测量外泌体的浓度， 对外泌体进行定量。无法研究细胞与外泌体的相互作用以及外泌体功能；confocal 可以拍摄到细胞分泌和吞 噬外泌体，但是因为缺乏合适的量化参数，无法对吞噬过程进行量化分析，也无法定量产生的外泌体。而且 confocal 的通量太低，结果也可能存在人为偏倚性而不够客观。Amnis 量化成像流式细胞分析技术，很好地 解决了上述研究手段存在的问题， 是目前为止研究外泌体产生机理及外泌体功能的最佳方法。 Amnis 能够同 时采集 12 个检测通道中
4、的细胞和颗粒物图像，其中包括明场、暗场，以及 10 个荧光通道。Amnis 每个检测 通道都有 100 余种量化参数，如面积、直径、长度、厚度、细胞短轴与长轴比值、荧光强度等等，这些参数 可以提供传统流式和显微成像设备都不具备的量化统计学功能，获得全新的细胞或颗粒物量化统计学数据。 Amnis 采用最先进的用于航空遥拍的 TDI CCD（Time Delay Integrated CCD）收集荧光信号，可以采集到液 流中快速移动的细胞和小颗粒物的清晰图像，对数万乃至数以十万的细胞或小颗粒物的荧光信号进行量化 分析。Amnis 既具有显微成像的功能，可以呈现细胞和小颗粒物的细节，又具有对海量数据
5、进行快速分析的 统计学功能。因此，Amnis 量化成像流式细胞分析技术可以为外泌体的研究提供强有力的技术支持。 一，一， 定量定量检测样本中的外泌体检测样本中的外泌体 过去十年间，外泌体研究成为新的研究热点，人们意识到微小的外泌体在生物体中扮演了非常重要的 角色，例如外泌体参与了从凝血到细胞间信息交流等各种生理过程，而且外泌体与动脉硬化、风湿和肿瘤 等疾病相关。因此外泌体有望成为疾病风险预估或者临床诊断的工具。由于外泌体的直径只有几十纳米， 而且产生外泌体的样本复杂多样，因此迫切需要开发一种可以精确定量检测样本中外泌体的技术。量化成 像流式细胞技术因其灵敏度高、通量高、检测样本量低，并且适合检
6、测全血、血浆、白细胞上清液等复杂 的样本，成为定量检测细胞分泌产生外泌体的最佳研究工具。“Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry”文章中报道了利用Amnis检测到了直径20nm微珠 的荧光信号，并拍摄到了直径为100nm的微珠的图像。这个结果也证明了Amnis的灵敏度和图像分辨率足 够检测直径范围在30-100nm的外泌体。 此外，文章中还定量检测了嗜中性粒细胞受到 TNF- 刺激后产生的微囊泡，以及随着 TNF- 刺激时间 延长，微囊泡生成的
7、动力学曲线。这些微囊泡中就包含了外泌体。利用荧光抗体标记母体细胞，可以通过微 囊泡携带的荧光标记， 定量分析微囊泡的来源。 文章中检测了 6 个健康供体血浆中的微囊泡， 并对这些不同 来源的微囊泡进行了定量分析。 二，二， 研究外泌体与研究外泌体与肿瘤细胞和免疫肿瘤细胞和免疫细胞细胞之间的之间的互作互作 外泌体因其来源不同而功能各异，有些可以刺激免疫反应，有些可以抑制免疫反应，有些具有诱导免 疫耐受的作用。“Exosomes Containing Glycoprotein 350 Released by EBV-Transformed B Cells Selectively Target B
8、Cells through CD21 and Block EBV Infection In Vitro”主要研究了来源不同的外泌体是否可以选择性 地被人类外周血中不同的免疫细胞吞噬。文章中分别富集了来源于DC细胞、LCL1细胞以及人奶中的外泌 体，并把这些不同来源的外泌体用PKH67标记后，与人外周血单个核细胞孵育。 Amnis具有100多种量化参数，可以定量分析许多显微成像设备无法定量分析的内容，例如细胞的形态 变化、细胞内吞等。Amnis的内吞参数（Internalization）主要用来测量细胞内与细胞外的荧光比值，内吞 参数值越大，代表细胞吞噬了更多的颗粒物。如上图所示，绿色标记的外泌
9、体主要被HLA-DR+ CD14+单核 细胞吞噬，有些外泌体粘附在细胞膜表面，有些外泌体进入细胞后移动到细胞中心位置，Amnis可以准确 区分上述两种情况。通过统计分析不同来源的外泌体被单核细胞吞噬的情况，作者发现DC细胞和人奶来源 的外泌体更容易被单核细胞吞噬，而LCL1来源的外泌体则与单核细胞亲和度不高。 三，三， 研究研究肿瘤细胞对外泌体吞噬功能肿瘤细胞对外泌体吞噬功能 膀胱癌是常见的非皮肤源性恶性肿瘤，近年来膀胱癌的发病率呈现稳步上升态势，可是对于膀胱 癌的早期检测以及风险分级方面的研究却进展缓慢。此外，膀胱癌的复发和转移也是威胁患者生命的 重要因素。因此，迫切需要确认新的生物标志物，
10、研究膀胱癌的转移机制，可以为膀胱癌的治疗指明 方向。有文献报道膀胱癌细胞可以产生外泌体，这些外泌体中含有对肿瘤的转移起到重要作用的蛋 白。“Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells”文章中利用Amnis 检测了膀胱癌细胞对外泌体的内吞，证明了内吞作用是随着外泌体的数量增加和时间延长而增多，而 且文章还发现内吞作用受到到肝素钠的阻断。 图中黄色的点状结构是PKH26标记的外泌体，Amnis的计点（spot count）模块可以自动统计特定区域 内的点状荧光信号的数量，这些点
11、状荧光信号即可代表外泌体的信号。利用计点模块可以定量膀胱癌细胞 中吞入的外泌体的数量。 三，三， 研究吞噬外泌体后细胞形态功能等方面的变化研究吞噬外泌体后细胞形态功能等方面的变化 除了前文中介绍的Amnis量化成像流式细胞技术的内吞模块、计点模块以外，还具有细胞凋亡、细 胞周期、细胞形变、蛋白转位、共定位等智能模块。这些模块可以用于研究外泌体与细胞间的相互作 用、细胞形态功能等方面的变化，有利于进一步探索外泌体的作用机理和功能。以细胞周期模块为 例，Amnis在研究细胞周期变化时，不仅可以提供G0/G1期、S期和G2/M期细胞的百分比，还可以通过 遗传物质在细胞核内形态的变化，根据细胞核面积以
12、及最大荧光强度等特殊的量化参数，分析细胞分 裂前期、中期、后期及末期等几个亚期。当分析细胞健康状态时，Amnis可以通过细胞核大小和形态的 变化，区分凋亡细胞和坏死细胞。另外Amnis还可以通过蛋白转位模块研究NFkB等蛋白从细胞胞浆到 细胞核内的转运情况，从而帮助科学家研究外泌体与细胞信号传导之间的关系。 细胞细胞周期的细化分析：周期的细化分析： Prophase Metaphase G1=47% S=32% G2/M=19% Anaphase Telophase 关于关于 Amnis 量化成像流式细胞量化成像流式细胞分析技术分析技术: 流式细胞技术在过去的 30 年中，实现了长足的发展，
13、已成为生命科学研究不可或缺的研究手段。然而，科学 家们不难发现， 流式技术的数据结果始终无法突破散点 图和直方图的固定数据模式，除了圈门和计数，用户无 法探究细胞散点数据背后的更深层次的内涵。全新的 Amnis 量化成像分析流式细胞技术将流式细胞技术的 统计学力量， 和荧光显微镜在细胞功能及形态学研究中 的细节展现能力与丰富内涵完美结合， 特别是其图形量 化分析技术，将流式细胞技术的应用范围推至了全新的高度，使其可以完成上述两项技术单独无 法实现的诸多应用。目前该技术已广泛应用于各个研究领域，包括生物化学、药物研发、血液、 免疫、微生物、海洋、肿瘤、寄生虫、干细胞、毒理、病毒等等，已发表超过
14、300 篇高水平文章。 更多详情 Reference paper: 1. Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles Emanuele Cocucci and Jacopo Meldolesi Trends in Cell Biology, June 2015. Vol. 25. No.6 2. Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry
15、 Sarah E. Headland, Helin R. Jones, Adelina S.V.DSa, Mauro Perretti 186:73-82 4. Characterization of Uptake and Internalization of Exosomes by Bladder Cancer Cells Carrie A. Franzen, Patricia E. Simms, Adam F. Van Huis, Kimberly E. Foreman, Paul C. Kuo, and Gopal N. Gupta Hindawi Publishing Corporation BioMed Research International Volume 2014, Article ID 619829, 11 page
