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1、无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常用的是Balbc/c 小鼠，6-8 周龄，一种抗原一次性注射 2-3 只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相
2、对较好；首次注射抗原 100 微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14 天）二次免疫注射抗原 50 微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在；间隔两周左右时间（14 天）三免小鼠注射抗原 50 微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在；间隔 7-10 天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于 50热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或刀片剪去尾尖 12mm，用试管接流出
3、的血液，同时自尾根部向尾尖按摩。取血后用棉球压迫止血并用 6%液体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量 0.1ml。方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住尾巴，用一次性 1ml 注射器穿刺血管，用 10 微升移液枪及时吸取全血 2.5微升，加在盛有 97.5 微升的 PBS 缓冲液中稀释 10 倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释测定效价，读数到阴性血清值的 2.1 倍，合理效价应高于 12.8 万倍。实际操作显示，采血使用剪尾方法较好，一人固定小鼠，另一人直接在尾端剪掉 1-2mm，从尾根部向尾尖部
4、按摩，在尾端可见一滴血，吸取 2.0 微升加在 2ml的 PBS 溶液中，直接稀释 1000 倍，混匀，再倍比稀释测定效价；当日或次日，对全血用生理盐水进行倍比稀释，测定抗体效价，效价未达到标准，则继续进行常规免疫，效价达到标准，则选择效价最高的一只小鼠作为脾细胞源鼠，并在细胞融合三天前尾静脉注射加强免疫。随后，取冻存好的瘤细胞进行复苏、培养、扩瓶，直到单只小鼠细胞融合需要稳定良好生长瘤细胞培养液约为 120ml（大约一周可以完成） ，之后可进行细胞融合实验；在细胞融合三天前（72-96 小时） ，直接尾部静脉注射 50 微克抗原加强免疫；先用烧杯固定小鼠露出尾巴，用温水（水温约 50 度左右
5、）泡大约 2 分钟，这样能使血管充分舒张。用干棉球擦干；用 1 毫升注射器选择两侧较浅的静脉穿刺注射抗原，位置选择尾部中下 2/31/2 处比较好,从下向上扎，万一一次扎不进，还可以继续使用此血管。具体操作是左手食指和中指上下夹注你所选择血管的靠近身体的一边,无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾(建立一个穿刺的平面的作用), 拇指压住所选血管的尾尖端,上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动为宜.( 否则容易人为建立穿刺的角度,而使右手持穿刺针穿刺过深,导致穿刺失败.) 右手持穿刺针,稍微挑起皮肤一点,就可以平着进针,看到回血表明成功,还可以回抽,见到回血后表明穿刺已进入血管,可以给药.穿刺结
6、束后,用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血.良好并彻底的止血对于血管可以起到很好的保护作用,这对于需要天天穿刺给药是非常有用的（一般小鼠需要按压时间很长，否则易引起出血） 。如果尾部静脉注射未能成功，则进行腹腔注射。瘤细胞饲养骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653 等。细胞的最大密度不得超 106ml，一般扩大培养以 14 或 6 进行稀释传代，每 35 天可传代一次。上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。1、显微镜观察
7、细胞形态，呈较亮表明细胞生长良好，反之颜色较深，可见一些小黑点，可能细胞已大部分死亡；2、状态良好，装入二氧化碳培养箱静置培养 37，5%二氧化碳浓度，T25 细胞培养瓶培养液可加 15ml 含 10-20%的灭火小牛血清 DMEM 培养基进行培养（酒精擦洗，有菌及时擦洗，常规一月一次，常开）3、每日显微镜观察细胞状态，贴壁较多（细胞挤在一起几乎无空白区域）或培养液颜色变黄换液（倒出上清液，加新鲜培养液大体盖住底部，细胞过多在加新鲜培养基前吹打）一般 3-5 可重新长满4、换液 2-3 次5、生长稳定后，扩瓶，先 1:4（细胞液：新鲜培养基）扩瓶，之后可适当增大比例，扩增到自己需要的培养液；6
8、、冻存，取生长良好的细胞液，吹打混匀，转到 50ml 离心管中离心，1000rpm 10min 弃上清， 底部为白色沉淀，加新鲜冻存液（DMEM 60 FBS30 DMSO 10 双抗 1） ，分装在 2ml 冻存管中加 1ml （约每 5ml 细胞液原液对应 1 管1ml） ，在管子上面注明日期、名称，先在 4 度中静置数小时，再在液氮液面上悬 3060min，之后放入液氮中冻存；7、复苏，拉线取出冻存管，用漂悬浮在盛有 37 度水的烧杯，烧杯置于水浴锅中，待融化后转移到含有新鲜培养基的细胞培养瓶中混匀，进行培养，在次日一定要更新培养基，去除 DMSO，以有利于后续的培养；8、 细胞融合时，
9、将 3 瓶生长良好的细胞液转移在 50ml 离心管中，1000rpm 10min，弃上清；加 30ml DMEM 离心洗涤一次，加 10ml 重悬混匀，血细胞计数板计数备用；在实际培养中，大概三天后细胞基本可以长满，四天开始出现细胞死亡情况，五天后有半数细胞死亡，六天后大部分死亡。HAT 培养液浓度选择商品化 HAT 多为 50，先用不完全培养基溶解后（10ml 一管） ，按比例加到完全培养基中制成 HAT 培养基；HAT 一般含量偏高，做梯度培养瘤细胞实验选择合适的 HAT 培养液浓度；用 24 孔板和 SP2/0 进行在各孔中加等体积的培养液，培养细胞，待长成单层细胞后依照下表添加不同量的
10、 HAT 培养观察死亡情况；2 1.5 1.0 0.75 0.5 0.252 1.5 1.0 0.75 0.5 0.252 1.5 1.0 0.75 0.5 0.252 1.5 1.0 0.75 0.5 0.25选择第一天死亡半数细胞；第二天死亡大部分细胞；第三天全部死亡的浓度；在实际试验中，不同梯度的 HAT 均可导致瘤细胞的快速死亡，具体试验可选用2%，亦可选用 1%；饲养细胞制备在细胞融合前，三天内购买 Balb/c 或 KM 小鼠 2-3 只（个体易较大） ，在细胞融合当天制备饲养细胞；器材与试剂：解剖工具、5ml 玻璃注射器、96 孔板、50ml 离心管、血细胞计数板、HAT 培养液
11、、75% 的酒精、 250ml 烧杯；操作方法：1、将小鼠摘眼球或拉颈脱臼处死，浸泡在 75%酒精中 5min，随即放入超净台内，小鼠腹部朝上；2、酒精棉球腹部擦拭消毒，用止血钳将腹部皮肤拉开，完全露出腹膜；3、镊子小心提起小鼠腹部皮肤，注射 5ml DMEM 溶液，轻轻按摩腹部 1-2 分钟；4、用注射器吸出腹腔内液体，转于 50ml 离心管中，1000rpm, 10min，弃上清液；5、用 5ml HAT 培养液重悬沉淀，细胞计数，补加液体至细胞浓度为 2*105个/ml；6、加在 96 孔板中，每孔 100 微升，进行培养；(96 孔板约为 6 块)一般 18-24h 后细胞生长良好；在
12、制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞。初始饲养细胞均为小圆形，之后逐渐曾梭形，即巨噬细胞，可吞噬死亡细胞残片，梭形细胞较多时，周围会出现相对空白的区域，反之，巨噬细胞较少，在换液时应适当补充饲养细胞；脾细胞悬液制备免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中 B 淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫 3 天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时 B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。1、解剖三天（72-96 小时）前尾部静脉注射（难以操作可
13、腹腔注射） ，每只 50微克抗原加强免疫；2、解剖工具灭菌，单个牛皮纸包裹，在金属盒内灭菌；在小烧杯口裹上尼龙网，用绳子扎紧，牛皮纸包好灭菌；玻璃注射器牛皮纸包裹灭菌；3、摘眼球处死小鼠，采血分离血清待测；小鼠在 75%酒精中浸泡 5min，转到超净台内；4、解剖小鼠小心取出脾脏，剪刀碰到小鼠体外或使用次数较多则更换剪刀，以减少污染，取出脾脏后转移到盛有 5-10ml 的不完全培养基平皿中清洗，一般更换两个平皿，然后将脾脏转移到固定在灭菌烧杯（50ml 即可）的尼龙网上，用弯头眼科剪尽量剪碎，用 5ml 玻璃注射器内芯研磨脾脏；5、用不完全培养基缓慢冲洗，直到将脾脏细胞完全冲下；6、将烧杯内液
14、体转移到 50ml 离心管内，1000rpm 10min，弃上清；7、不完全培养基离心洗涤一次（也可以不做） ；8、用不完全培养基重悬沉淀（重悬要轻柔） ，获得脾细胞悬液；细胞计数，一般一只小鼠可得 1.0-2.5108 个脾细胞；细胞融合1）取对数生长的骨髓瘤细胞 SP20，1000rpm 离心 10 分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤 2 次。2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤 2 次。3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按 110 的比例混合在一起，在 50ml 塑料离心管内用不完全培养液洗 1 次，800rpm,10 分钟。4）弃上清，用滴管
15、(移液枪)吸净残留液体，以免影响 PEG 的浓度。5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动（可将离心管在手臂上轻磕） 。6）在 37下融合，用盛满水的大烧杯，预热到 37，在 60 秒内延管壁缓慢加入预热的 1ml45PEG(Merek, 分子量 1500)含 5DMSO，边加边转动离心管；静置作用 60 秒钟，若冬天室温较低时可延长至 90 钟；加预热的不完全培养液，终止 PEG 作用，每隔 1 分钟分别加入 1ml，2ml， 3ml，4ml，5ml。7）离心，800rpm，6 分钟。8）弃上清，用已经配制好的 HAT 培养液取少量轻轻混悬融合细胞，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散
16、开，再混入培养液中；9）根据所用 96 孔培养板的数量，补加完全培养液。10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的 96 孔板，200l孔，37、5CO2在中间适当时间，制备饲养细胞，离心、重悬，并混入到 HAT 培养液中，与融合细胞一起铺到 96 孔板中；选择性培养（筛选杂交瘤）一般选择 HAT 选择培养液维持培养三天，进行换液，每孔取 100 微升加 100 微升（这时可以考虑适当补充饲养细胞） ，观察见梭形细胞较多或原细胞被吞噬较多较好；在培养三天，孔内相对空白较好，进行再次换液或直接进行效价检测，发现有阳性孔，则及时进行克隆化。检测一般取样 100 微升，选择效价在 2.0 以上者，在观察对应孔细胞是否存活，存活则可克隆化，不存活可考虑放弃或在 24 孔板内加饲养细胞培养一段时间，这时改用 HT 培养液；抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底 110 面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞
