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1、齐鲁工业大学 生物工程学院 马美范 副教授,理化指标常用检测方法介绍,主要内容,碳水化合物（糖）的检测 蛋白质、氨基酸的测定 酸度的测定 微量元素的测定,第1章 碳水化合物含量的检测,主要内容 概述 还原糖含量的测定 蔗糖含量的测定 总糖含量的测定,第一节 概述 一、定义和分类 1.定义:碳水化合物统称为糖类，是由碳、氢、氧三种元素组成的一大类化合物。在这类化合物中有许多氢与氧的比例数和水一样，因此常被称为碳水化合物。 2.分类： （1）按能否提供能量营养分为 有效碳水化合物：能提供能量营养。 无效碳水化合物：不能提供能量营养。指人们消化系统和消化系统的酶不能消化分解吸收利用的物质，又称膳食纤
2、维。,二、糖类物质的测定方法,第二节 还原糖含量的测定,一、可溶性糖类的提取和澄清 可溶性糖通常是指葡萄糖、果糖等游离单糖及蔗糖等低聚糖。要测定首先要进行提取纯化，然后才能测定。 （一）提取 1.常用的提取剂：水和乙醇 1）水：用水作提取剂，温度控制在40-50，提取效果好。温度高，可溶性淀粉和糊精也被提取。提取糖外，还有色素、蛋白质、可溶性果胶、可溶性淀粉、有机酸等干扰物质。防止糖加热水解，提取液应为中性。 2）乙醇：用70%-75%的乙醇溶液，避免提取蛋白质、淀粉和糊精。,2.提取液制备的原则 提取液的制备方法要根据样品的性状而定，应遵循以下原则: (1)确定合适的取样量和稀释倍数； (2
3、)含脂肪的样品,需经脱脂后再进行提取； 含有大量淀粉、糊精及蛋白质的食品，用乙醇溶液提取； 含酒精和二氧化碳的液体样品，应在水浴上加热除去挥发组分。加热时应保持溶液呈中性，以免造成低聚糖的水解及其单糖的分解。,（二） 提取液的澄清 1、常用澄清剂要符合三点要求 （1）能较完全地除去干扰物质； （2）不吸附或沉淀被测糖类，也不改变被测糖分的理化性质； （3）过剩的澄清剂应不干扰后面的分析操作，或易于除掉。 2、常用澄清剂的种类 3、澄清剂的用量 用量必须适当，太少，达不到澄清的目的;太多，会使分析结果产生误差。,一般先向样液中加入13 mL 澄清剂，充分混合后静置。 二、还原糖的测定 还原糖是指
4、具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离的半缩醛羟基的双糖都具有还原性。 根据糖分的还原性的测定方法叫还原糖法。 还原糖的测定方法很多，其中最常用的有碱性铜盐法、铁氰化钾法、碘量法及比色法等。,（一）碱性铜盐法 碱性酒石酸铜溶液是由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为酒石酸钾钠等配成的溶液。在加热条件下，还原糖能将碱性酒石酸铜溶液中Cu2+ Cu+ Cu2O。根据此反应过程中定量方法不同，碱性铜盐法分为直接滴定法、高锰酸钾法、萨氏法及蓝-爱侬法等。,1.直接滴定法（GB/T5009.7-2008 第一法） （1）原理：将一定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生
5、成天蓝色的氢氧化铜沉淀； 这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。 在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀； 这种沉淀与亚铁氰化钾络合成可溶的浅黄色配合物；二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色消失，即为滴定终点； 根据样液消耗量可计算出还原糖含量。,（Cu2+ + 还原糖 Cu2O） Cu2O+K4Fe(CN)6+H2OK2Cu2Fe(CN)6+2KOH （2）适用范围及特点 本法又称快速法，它是在蓝一爱侬法基础上发展起来的，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定
6、终点明显。 适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。 本法是国家标准分析方法。,（3）试剂的配制方法 碱性酒石酸铜甲液：称取硫酸铜15.00g及0.05g次甲基蓝,溶于水中并稀释至1000mL。 碱性酒石酸铜乙液：称取50.00g酒石酸钾钠及75g NaOH ，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000mL，贮存于具橡胶塞玻璃瓶中。 乙酸锌溶液 亚铁氰化钾溶液 葡萄糖标准溶液：准确称取经98100干燥至恒量的无水葡萄糖1.0000g，加水溶解后移入1000mL容量瓶中，加入5mL盐酸,加水稀释至1000mL。
7、,（4）测定方法 样品处理 取适量样品，对样品进行提取，提取液移入250 mL 容量瓶中，慢慢加入 5 mL乙酸锌溶液和 5 mL亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，摇匀后静置30分钟。用干燥滤纸过滤，弃初滤液，收集滤液备用。,碱性酒石酸铜溶液的标定 准确吸取碱性酒石酸铜甲液和乙液各 5.00mL，置于250 mL 锥形瓶中，加水10mL，加玻璃珠3粒。从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在2分钟内沸腾，趁热以每2秒1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。 记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。,F = V F10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量
8、, g; 葡萄糖标准溶液的浓度, gmL； V标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。,样品溶液测定 .样品溶液预测 吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各5.00mL，置于250mL锥形瓶中，加水10.0 mL。加玻璃珠3粒，加热使其在2分钟内至沸，趁沸以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要始终保持溶液呈沸腾状态。待溶液蓝色变浅时，以每2秒1滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。,. 样品溶液测定 吸取碱性酒石酸铜甲液及乙液各 5.00 mL，置于250 mL 锥形瓶中,加水10mL, 加玻璃珠2粒，从滴定管中加入比预测时样品溶液消耗总体积少1 mL的样品溶液，加
9、热使其在2分钟内沸腾，趁沸以每2秒1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。 记录消耗样品溶液的总体积。同法平行操作3份，取平均值。,（5）还原糖含量的计算： 还原糖（以葡萄糖计，g/L）= 式中： F斐林氏甲、乙液各5.00mL相当于某种还原糖 的克数，单位为克（g）； V样品取样品体积，单位为毫升（mL）； V测定时消耗样品溶液的平均体积，单位为毫升（mL）； 250样液定容体积。,（6）说明与讨论 此法测得的是总还原糖含量。 在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2+，得到错误的结果。 碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合。 滴定必须在沸腾条件下进行，其原因
10、一是可以加快还原糖与Cu2+的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。,滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 样品溶液要进行预测。 影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。反应液的碱度直接影响二价铜与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。,2.高锰酸钾滴定法（GB/T5009.7-2008 第二法） (1)原理 将一定量的样液与一定量过量的碱性酒石
11、酸铜溶液反应，在加热的条件下，还原糖将二价铜还原为氧化亚铜，经抽气过滤，得到氧化亚铜沉淀，加入过量的酸性硫酸铁溶液将其氧化溶解，而三价铁盐被定量地还原为亚铁盐，用高锰酸钾标准溶液滴定所生成的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜的量，再从检索表中查出与氧化亚铜量相当的还原糖量，即可计算出样品中还原糖含量。,(2)适用范围及特点 本法是国家标准分析方法，适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液也不受限制。方法的准确度高，重现性好，准确度和重现性都优于直接滴定法。 但操作复杂、费时； 需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表； 需要古氏坩埚 或垂融漏斗过滤。,3.蓝-爱侬法 （1）原理 用样品试液滴
12、定一定量、煮沸的碱性酒石酸铜溶液，以次甲基蓝为指示剂，达到终点时，稍微过量的样品试液将蓝色的次甲基蓝还原为无色的隐色体，而显出氧化亚铜的鲜红色沉淀。根据试液的用量，根据公式计算或查蓝-爱农专用检索表，求出样品中还原糖的含量。 （2）适用范围及特点 本法又称Lan-Eynon Method，准确度高、重现性好，是一种快速简单的方法。国际标准方法，但该法试剂操作要求严格，终点不易判断，对于初学者不易掌握。,4.萨氏(Somogyi)法 (1)原理 将一定量的样液与过量的碱性铜盐溶液共热，样液中的还原糖定量地将二价铜还原为氧化亚铜，生成的氧化亚铜在酸性条件下溶解为一价铜离子，并能定量地消耗游离碘，碘
13、被还原为碘化物，而一价铜被氧化为二价铜。剩余的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定，同时做空白试验，根据硫代硫酸钠标准溶液消耗量可求出与一价铜反应的碘量，从而计算出样品中还原糖含量。各步反应式如下： 2Cu+ + I2 = 2Cu2+ +2 I- I2 + 2 Na2S2O3 = Na2S4O6 + 2 NaI,(2)适用范围及特点 该法又称Somogyi法，是一种微量法，检出量为0.015-3mg。灵敏度高，重现性好，结果准确可靠。因样液用量少，可用于生物材料或经过层析处理后的微量样品的测定。终点清晰，有色样液不受限制。,(二)碘量法 1、原理 样品经处理后，取一定量样液于碘量瓶中，加入一定量过量的碘
14、液和过量的氢氧化钠溶液，样液中的醛糖在碱性条件下被碘氧化为醛糖酸钠，由于反应液中碘和氢氧化钠都是过量的，两者作用生成次碘酸钠残留在反应液中，当加入盐酸使反应液呈酸性时，析出碘，用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，则可计算出氧化醛糖消耗的碘量，从而计算出样液中醛糖的含量。,醛糖 + I2 +3 NaOH = 醛糖酸钠 + 2 NaI +2H2O I2 + 2 NaOH = NaIO + NaI + H2O NaIO + NaI + 2 HCl = I2 + 2 NaCl + H2O I2+2Na2S2O3 =2NaI+Na2S4O6 2、适用范围 本法用于醛糖和酮糖共存时单独测定醛糖。 3、应用,
15、（三）3,5二硝基水杨酸比色法 1、原理：在NaOH和丙三醇存在下，还原糖能将3,5二硝基水杨酸比色法中的硝基还原为氨基化合物。此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈橘红色，在540nm波长处有最大吸收，其吸光度与还原糖含量呈线性关系。 2、方法特点 （1）准确度高、重现性好，操作简便、快速； （2）适合于大批量样品的测定，而且样品不需进行特别处理。,（四）还原糖测定仪法 （五）HPLC法 （六）酚硫酸比色法 1、原理：糖类物质与浓硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛衍生物；然后与苯酚反应，生成黄至橙色化合物，吸光度与糖含量成线性关系。 2、方法特点：简便、快速、灵敏、重现性好，适用于各类样品中还原糖的
16、测定，但要注意其他物质对测定结果的干扰。,第三节 蔗糖含量的测定 蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定条件下，蔗糖可水解为具有还原性的葡萄糖和果糖（转化糖）。因此，可以用测定还原糖的方法测定蔗糖含量。对于纯度较高的蔗糖溶液，其相对密度、折光率、旋光度等物理常数与蔗糖浓度都有一定关系，故也可用物理检验法测定。 分析方法 GB/T 5009.82008食品中蔗糖的测定 （一）HPLC法 （二）直接滴定法或蓝-爱侬法,第四节 总糖的测定 总糖通常是指具有还原性的糖(葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等)和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量。 总糖的测定通常是以还原糖的测定方法为基础的，常用的是直接滴定法或蓝-爱侬法。 原理 样品经处理除去蛋白质等杂质后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，以直接滴定法或蓝-
