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1、蛋白质组学及其在肾脏病研究中的应用,第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 第二节 蛋白质组学研究方法概述 第三节 蛋白质组学在肾脏病研究中的应用,主要内容,第一节 蛋白质组学的概念及其发展史,蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。,一、蛋白质组学的概念,蛋白质组学(proteomics),指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白
2、质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,蛋白质组学研究的内容,结构蛋白质组学 主要研究蛋白质的氨基酸序列、三维结构的解析、种类分析、数量确定等； 蛋白质结构测定主要是应用X-光衍射技术，蛋白质种类和数量测定主要是应用双向电泳，蛋白质鉴定的手段是质谱法； 功能蛋白质组学 研究蛋白质的功能，确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，蛋白质-蛋白质的相互作用等。现在蛋白质组学比较注重研究蛋白质类型与数量在不同种类、不同时间和条件下的动态本质。 在功能蛋白质组学或蛋白质相互作用方面，较常用的有酵母双杂交系统（包括单杂交、三杂交、反向杂交的系统）、免疫共
3、沉淀技术、表面等离子技术、荧光能量转移技术等。,二、蛋白质组学的产生与发展,1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。 2. 随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。 3. 因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 基因产物是否以及什么时候被翻译表达、翻译产物的相对浓度、翻译后修饰的程度等现象并不能从研究基因组中得到回答。 4. 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释。 5. 蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态，蛋白质作为生命活动的主要体现者。 20
4、世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。,产生背景,进 展,各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟： 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF） 1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议 我国也于1998年启动了蛋白质组学研究。,2001年的Science杂志已把蛋白质组学列为六大研究热点之一，其“热度”仅次于干细胞研究，名列第二。,2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月召开了中国蛋白质组学首届学术大会，2007年8月在广州召开了第五届学术大会，2004年
5、10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。,蛋白质组学的前沿,蛋白质组学的前沿大致分为3大方向： 针对已完成基因组或转录组研究的生物体或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组（或蛋白质表达谱）及其蛋白质连锁群，即组成性蛋白质组学研究； 以重要生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理/病理体系或过程的比较蛋白质组学研究； 蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学的研究。,第二节 蛋白质组学研究方法概述,一、蛋白质组表达模式的 研究方法,研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析。,蛋白质组表达模式（expression profile）：,
6、生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,研究流程,Functional analysis,State 1,State 2,2DE,PMF,MS/MS,LC-MS/MS,Database search,Differential analysis,?,（一）蛋白质组研究中的样品制备,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 也可以进行样品预分级，
7、即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,样品预分级的主要方法,蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等,样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,组织水平上的蛋白质组样品制备,临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。,激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM),可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。,（二）蛋白质组研究中的样品分离,双向凝胶电泳two-dimensi
8、onal electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。,原 理,第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由OFarrell等创立。,特 点,可分离10100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配,第一向IEF电泳,传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。 Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电
9、聚焦技术，Grg等成功地将之应用于双向电泳。 优点,固相pH梯度等电聚焦的优点,克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。,第二向SDS-PAGE电泳,垂直板电泳 水平超薄胶电泳,2-DE技术的缺点,极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。,凝胶的图像处理分析及细胞蛋白谱的建立,典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-D
10、E数据库的建立：,无腔眼金鱼胚胎,正常眼金鱼胚胎,大鼠肝脏蛋白质双向凝胶电泳图谱，上样量300g，银染。,SHR组,肝阳上亢组,天麻钩藤饮高剂量组,pH5,pH8,pH5,pH8,pH8,pH5,大鼠肝脏差异蛋白质双向凝胶电泳局部图谱，上样量300g，银染。,SHR组,肝阳上亢组,天麻钩藤饮高剂量组,新型非凝胶技术,液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE,液质联用技术（LC-MS/MS）,蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序
11、列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。,根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。,多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）,多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology),CE对蛋白质的分离与2-DE比较，可以实现在线自动分析，并可用于分子量范围不适于2-DE的样品分析。此外，CE还具有灵敏度高、速度快、样品需求少、成本低、种类多、分离范围广等优点。 缺点在于复杂样品的分离尚不完全。,（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定,传统方法：蛋白质微量测序 氨基酸组成分析,新型蛋白质鉴定技术 质谱（MS）法,基本原
12、理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。,“软电离”的特点,分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）,主
13、要质谱类型,MALDI-TOF/MS用一定波长的激光打在样品上，使样品离子化，然后在电场力作用下飞行，通过检测离子的飞行时问(Time Of Flying，TOF)计算出其质量电荷比，从而得到一系列酶解肽段的分子量或部分肽序列等数据，最后通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质。该技术精度高、分析时间短，可同时处理许多样品，是高通量鉴定的首选方法。,ESI-MS是在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化，离子化的肽段转移进入质量分析仪，根据不同离子的质荷比差异分离，并确定分子质量。此法分析肽混合物、鉴定蛋白质时，可对每一肽段进行序列分析，综合MS数据鉴定蛋白质，大大提高了鉴定的准确度。ESI-MSMS
14、与HPLC相结合可对分子量较大的蛋白质酶解肽谱进行定性定量分析。,鉴定和注释蛋白质的路线,通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配,质谱基础,串联质谱图,目 录,仪 器,MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小,肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因,样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图
15、。,操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小,续：,组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）,联合技术精确鉴定蛋白质,（四）蛋白质组学研究的生物信息学,生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。,构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建,应 用,蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础,瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上
16、最大、种类最多的蛋白质组数据库。 目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST数据库。,dbEST数据库,由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（EST）,肽序列标签(PST)或部分序列信息最适合查寻,概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。,（五）定量蛋白质组学研究,低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化,蛋白质定量的难点,1基于双向凝胶电泳的定量 蛋白质组研究策略,双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种方法。 荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）,GE Health推出的荧光差异双向电泳(Ettan DIGE)系统可同时在一块2
