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1、第六章 转基因动物生物安全,一、定义 转基因动物是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，且外源基因能稳定地遗传给后代的遗传工程动物。 转基因动物研究是人类按自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，在技术上依赖分子生物学、动物胚胎和配子操作技术。根据不同的目的，转基因动物操作可以简单地划分为四种类型： 疾病抵抗型转基因动物； 利用转基因动物制药； 动物改良型肉质、长速、代谢等； 基础生物学研究疾病和药物筛选模型等。 生产转基因动物的常用方法有： 原核期胚胎显微注射法、精子载体法、慢病毒载体法、胚胎干细胞介导法、体细胞克隆介导法、人工染色体介导的基因转移法等。（参见
2、第四章）,外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系,二、转基因动物研究进展 1966年，Lin发明了显微注射法，拉开了全球转基因动物研究的序幕。 1974年，Jaenisch把猿猴病毒SV40注入小鼠囊胚腔，得到部分体组织中含有SV40 DNA的嵌合体小鼠；并利用反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因组，创建了世界上第一个转基因小鼠系。 1977年，Gordon首先用显微注射的方法将外源mRNA源和DNA注射到非洲爪蟾胚胎，发现被注入的核酸
3、完全有功能。 1980年，Gordon等采用显微注射的方法将猿猴病毒和人单纯疱疹病毒的thymidine kinase基因整合后的质粒直接注入小鼠受精卵原核中，产生了世界上第一只转基因小鼠。 1981年，Gordon和Ruddle创造了新名词 “转基因”transgenic 1982年，Palmiter等采用显微注射法将人的生长激素基因注射到小鼠受精卵雄原核中，首次获得整合并表达生长激素外源基因的超级转基因小鼠，生长速度快24倍，体形大1倍。,1996年7月5日，世界上第一只克隆羊“多莉”在英国苏格兰卢斯林研究所的试验基地诞生。,从1只6岁雌性的芬兰多塞特白面绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，放入低浓
4、度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称为供体细胞； 从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，称之为受体细胞；,利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。 将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多莉。,多莉的诞生,转基因动物研究的里程碑,我国的转基因动物研究进展 1984年，陆德裕等将人-珠蛋白基因注入小鼠受精卵，得到 转基因小鼠，开启了中国转基因动物研究的先河。
5、1985年，1986年分别获得了含人生长激素（MT-hGH）基因的转基因 泥鳅和小鼠，首次在国际上成功获得了转基因鱼。 1987年，获得含有大肠杆菌galK（半乳糖激酶）和gpt（谷丙转氨酶） 基因的转基因小鼠。 1990年，国家“863”计划将转基因山羊乳腺生物反应器研究列入重大项目，中国农业大学等机构获得动物乳腺生产的IBDV疫苗和干扰素。 之后相继获得含HBsAg基因的转基因兔、转基因猪；含EPO和人HBsAg的乳腺特异性表达的转基因山羊；含人凝血因子IX的转基因山羊（1998）；含人血清白蛋白基因的转基因奶牛（1999）。 2001年，周江等在基因剔除研究中获得了国内首例Smad2条件
6、基因打靶小鼠。,2005年，王晓梅等采用共培养和脂质体介导方法将金黄地鼠附睾内的精子与NFB-luc+质粒共孵育后，与成熟卵母细胞进行体外受精，阳性胚胎获得率平均为10%。 2006年，张敬之等在国内首次用慢病毒载体法成功制备GFP转基因小鼠。 2008年，吉林大学的欧阳红升教授成功获得了带有猪瘟病毒抗性的转基因猪 三、 转基因动物存在的问题2个方面： 1、研究中存在的问题 转基因动物的成功率低。以显微注射法为例，一则统计资料表明： 小鼠2.6% 大鼠4.4% 兔1.5% 绵羊0.9% 猪0.7% 牛0.7% 转基因动物生产成本高。据Wau等计算，生产一头祖代转基因猪需花费2.5万美元，生产一
7、头转基因牛需花费50万美元。,体细胞克隆等技术环节还很薄弱，有些技术会对动物健康产生危害。由于基因整合机制尚不清楚，转基因在宿主基因组中的行为难以控制，转基因插入可能导致内源基因破坏或失活，也可能激活原本关闭的基因（癌基因等），导致阳性个体不育、胚胎死亡、四肢畸形等。 大部分转基因（尤其是cDNA）表达水平低得难以检测。而个别转基因的表达水平又太高，高水平表达的外源基因对宿主动物是很不利的。 Wright G等1991年生产的转 h-抗胰蛋白酶的绵羊，其中一只转基因羊产羔后乳汁中h -抗胰蛋白酶的水平高达60 g/L，这是宿主动物难以承受的。 2、产业化的安全性问题 转基因动物携带外源基因，释
8、放至环境中可能通过杂交导致“基因逃逸”，使外源基因转到其野生近缘种造成“基因污染”，危及生物多样性安全。 有实验显示转鲑鱼GH基因的雄性青鳉有交配优势，释放至自然水体可能会造成野生青鳉种群的灭绝。,对两个相同生长阶段的转GH基因银大马哈鱼与非转基因鱼在有捕食者存在（放入较大规格的大西洋鲑）时的存活与生长状况进行观察，发现转基因鱼具有与非转基因鱼相似的竞争能力，在有捕食者存在的环境中转基因鱼的死亡率并没有升高，且仍能维持较快的生长速度，所以如果转基因鱼进入自然环境，其相似的竞争能力和存活率就有可能使其竞争取代野生鱼。 转基因动物器官移植可能会增加人兽共患病的传播机会。 转基因动物生产的食物有可能
9、使食用者发生过敏反应。 同时转基因动物的研究还将会引发一系列社会伦理问题。 3、提高转基因表达的策略 导入大片段 大部分转基因研究中由于载体承载能力的限制，所构建的基因构件较小，因此整合后的位置效应更明显。细菌人工染色体载体（可承载300kb）和酵母人工染色体载体（可承载1000kb）使大片段基因转移成为可能。,如：要增加某一酪蛋白在乳汁中的含量，可导入该酪蛋白基因及与之连锁的酪蛋白基因。牛的4个酪蛋白基因连锁在6好染色体上，达250kb，连锁基因相互调节，使各酪蛋白基因的表达水平达到理想状态 共整合与基因搭救 即将表达水平较高的基因与表达较低的基因一同整合进宿主细胞的基因组中。 Clark（
10、1992）等将oBLG（绵羊-乳球蛋白）-h1AT cDNA（1:1）及oBLG与oBLG-hFIX cDNA（3:1）注入小鼠原核期胚胎，结果h1-AT与hFIX的表达都得到提高 增添基质附着区 基质附着区可能是结构基因的界域，将染色质分成许多可独立调控的单元。 Mcknight（1992）等将鸡溶菌酶基因的基质附着区（A因子）与小鼠WAP基因组成的杂合基因导入小鼠基因组，结果含A因子的杂合基因在整合外源基因的11个鼠系中均获得表达，但表达水平并没有提高。,四、转基因动物产业化进展 据统计，全球现有以转基因技术为核心的公司超过40家，已成为21世纪生物技术领域的支柱产业。 1998年全球动物
11、生物技术产品销售额估计为6.2亿美元。 预计到2010年，仅在农业领域销售额将达到110亿美元， 其中75亿美元来自转基因动物品种； 而利用转基因动物制作生物反应器生产药物和功能蛋白的销售额预计可达500亿美元。 促进动物生长、提高畜产品产量、改善产品品质 动物抗病育种 生产药用蛋白 生产人营养保健（医疗）品,生产可用于人体器官移植的动物器官 建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型，制作策略： 基因过量表达 基因敲除或敲入 病毒或其它病原的DNA插入诱变,1、在医药领域的应用 异种器官移植 据统计，截至2003年底，全世界共施行各种器官移植99.8万例次； 至2008年，我国器官移植已累计
12、超过10万例次，仅次于美国 器官供体来源不足已成为器官移植发展的瓶颈问题,猪在器官大小、结构和功能上与人类相似，有希望成为异种器官移植的理想来源 猪细胞表面的异种抗原与人体不相容，因此首先要解决器官移植过程中产生的排斥反应。 转基因技术可改造异种来源器官的遗传性状，成为国内外研究热点。 1995年，Rosengard等将人的补体抑制因子即衰退加速因子（hDAF）转移至猪胚中，有27头转基因猪的hDAF在其内皮细胞、血管平滑肌和鳞状上皮细胞等细胞中有不同程度地表达，缓和了异种器官移植过程中的超急性排斥反应。 猪用作异种器官移植在临床上的应用指南已在美国出台，其他一些国家也在进行之中。这为以猪作为
13、供体异种器官的移植展示了广阔的应用前景。 疾病和药物筛选的转基因动物模型 即通过精确地引入或失活与人类疾病及病原体相关基因的表达， 使转基因动物产生与人类相似的疾病，用于发病机理、药物筛选 和基因治疗等方面的研究。,例如：通过表达HBV基因建立的转基因小鼠模型，可对不同发育阶段的肝脏基因表达谱和蛋白组学进行研究，还可用于发现早期诊断的功能基因。 1996年Gringrich等将Probasin的启动子中一段454bp的序列与SV40序列连接，转入小鼠受精卵，建立了转基因小鼠前列腺癌动物模型。 2008年Roger等通过基因敲除方法构建了囊性纤维化双敲的猪疾病模型，能很好模拟人类新生儿囊性纤维化
14、症状，为疾病防控的研究带来了曙光。 2009年，Kragh等建立了7头人类老年痴呆症的小型猪疾病模型。 现已建立起动物模型的疾病类型有：癌症、动脉硬化、镰刀状细胞贫血、 地中海贫血例、肝炎、淋巴系统病、老年痴呆症、糖尿病和高血压等。 用于新药筛选，如Mehtali等建立了表达HIV-1-Tat的转基因小鼠模型，用于筛选抗HIV药物。 目前已获得的动物疾病模型约400 种， 其中基因敲除模型约310种， 基因过量表达的动物模型约40种，具有极大的推广和应用前景。,转基因动物疾病模型存在的问题 外源基因的随机整合可能引起插入突变； 基因敲除能灭活特定基因，但灭活的基因仍会有转录和翻译过程，有可能表
15、达出新蛋白，而新蛋白的行为无法预测，不可避免地会影响到分析的结果； 目前制作的疾病模型几乎都是小鼠，但某些基因的效应在不同物种间存在着一定的差异，从小鼠模型中获得的信息，并不能反映其在大动物和人类中的实际情况。 解决方案： 基因瞬间表达Dickins等（2007）将启动子四环素反应元件（TRE）与RNAi基因结合并转入小鼠，然后与含有四环素调控转录激活因子tTA的转基因小鼠杂交，制备同时含有2套元件的转基因小鼠。当对这些小鼠给予四环素时，可激活tTA系统，进而激活 TRE启动 RNAi；撤除四环素则可以停止 RNAi，实现 RNAi的可逆调控。 用进化上与人类相近的物种来制作模型，如偶蹄目的猪
16、、灵长目的猴等。,乳腺生物反应器生产重组蛋白药物 目前已获成功的动物生物反应器主要有以下几种途径： 在血液中表达活性成分 1992年Swanson等人制备了血液中含有人血红蛋白的转基因猪，为从人以外的动物体获取人血有效成分提供了新途径 通过尿液 1994年Kerr等成功获得了能在尿液中表达人类生长激素（GH）的转基因小鼠，GH含量高达0.5 g/L 通过蚕茧 1999年Tamura将原骨胶原蛋白基因转入蚕体内获得成功 通过鸡蛋蛋清表达功能蛋白 2002年Harvey 等将-内酰氨酶基因转入母鸡中，年产蛋330个，蛋清中含有约3.5 g外源蛋白； 同年美国TranXenoGen公司在转基因鸡蛋中成功表达了可用于治疗的单克隆抗体，表达量达1.5ng/mL；2007年，英国Roslin研究所培育出转有治疗皮肤癌的抗体miR24和人体干扰素-1的转基因母鸡，并且可以稳定的将新基因遗传给后代，实现了在输卵管中获得商业化治疗蛋白。,通过动物乳腺表
