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1、1,酶学分析技术,2,酶的活性是指酶的催化能力的大小，即酶促反应速度的快慢。在规定条件下，单位时间内底物减少的量或产物生成的量来表示。,3,酶活性的单位是指在特定的条件下，使酶促反应达到某一速度所需要的酶量。,4,1.惯用单位 由方法的作者自己规定在某特定 条件下生成一定量的产物为一个单位。 2.国际单位（IU） 在规定的实验条件下，每分钟催 化1mol底物发生反应的酶量。 3.Katal 1 Katal是指在最适宜的条件下， 每秒钟催化1mol底物发生反应的酶量。,6,酶活性单位的计算,酶单位/升=,（A测- A对）.V总.106,K.L. V标,规定保温时间,实际保温时间,7,酶促反应进程
2、曲线,产物浓度,反应时间t,线性期(B),偏离线性期（c）,8,Vm,S,Vm/2,Km,一级反应,混合级反应,零级反应,酶促反应底物动力学,9,Vmax S 米-孟氏方程式： V = Km + S,当酶促反应=1/2 Vmax时，Km值是酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mmol/L。 Km值是酶的特征常数之一。,1. v = VS /Km + S,2.Km = S (V/v - 1),3. Km 在一定的底物、pH、温度下是一个常数 (种类及底物性质有关),4.酶促反应亲和力1/Km,6.设计适宜的底物浓度10-20 Km,5.选择酶的最适底物,11,Km和Vmax的测定(
3、双倒数法),1 Km+ S Km 1 1,=,=,v,Vmax S,Vmax S,.,+,Vmax,12,1,S,1,V,Vmax,1,斜率=,Vmax,Km,-Km,1,双倒数作图法,13,酶活性测定的方法,1.终点法（又称二点法、固定时间法） 酶促反应一定时间后（从t1到 t2 )终止酶促反应，然后测定产物生 成的量或底物消耗的量。,14,优点 酶促反应已终止，比色计无需恒温装置，不必考虑显色剂对酶的影响。 缺点 无法了解酶作用这段时间里反应是否外于线性期。,15,每隔一定时间（1060秒）连续测定酶促反应中某一产物或底物变化量称为连续监测法。 优点 容易找到线性期、结果可靠、省时、省试剂
4、、省样品 缺点 反应速度易受温度、pH、底物浓度等因素的影响。,2.连续监测法（又称速率法）,16,酶学分析是将酶作为试剂的一种分析技术，它包括： 1.借助酶来测定某化合物 2.借助酶来测定另一种酶 特点：专一 高效 灵敏 温和,工 具 酶,17,在许多酶促反应中，底物或产物的变化量很难直接测定，常需要在反应体系中加入一种或一种以上的酶作为试剂。使第一个酶促反应的产物转变为易于检测的第二个酶或第三个酶的底物，通过这种偶联反应间接测定第一个酶的待测物浓度或待测酶的活性，这种作为试剂用的酶称为工具酶。,A B C P,18,酶偶联测定法,A B C P,EX Ea Ei,LDH、MDH、G6PD、
5、GLDH作工具酶均是以NAD（P）H为辅酶的脱氢酶。 P+NAD(P)H+H+ PH2+NAD(P)+,19,将水溶性的酶，通过物理或化学的方法，使其吸附、包埋或共价结合在固相载体上，成为不溶于水但仍保留催化活性的酶的衍生物称为固相酶。 优点：可反复使用 机械强度大 稳定性好 抗干扰性强,20,名称 室温 4 -20 乳酸脱氢酶 7 7 30 天冬氨酸氨基转移酶 2 14 30 丙氨酸氨基转移酶 2 14 30 肌酸激酶 0.3 0.6 2 碱性磷酸酶 0.5 6 600 淀粉酶 2 60 60,几种酶的稳定性（天）,21,同工酶的产生机理,不同基因位点编码 等位基因编码 多条肽链化学修饰产生
6、,22,电泳法 层析法 免疫化学法 动力学法 热失活法,同工酶的分离及鉴定,24,血浆酶的来源,血浆特异的酶 凝血酶类、纤溶酶类 外分泌的酶 淀粉酶类、脂肪酶类、碱性磷酸酶类 细胞内酶 ALT、AST、LDH,25,酶活性测定在临床诊断中的应用,在肝脏疾病诊断中的应用 ALT、AST、LCAT、OCT、ICD、GLDH、SDH、5-NT、-GT、ALP、MAO 特异性强、活性高的酶 在急性心肌梗死诊断中的应用 AST、LDH、CK（心肌酶） 在急性胰腺炎诊断中的应用 淀粉酶和脂肪酶,26,在骨骼疾病诊断中的应用 ALP 在肌肉疾病诊断中的应用 AST、CK、LDH、ALD 在前列腺疾病诊断中的应用 ACP 在肿瘤诊断中的应用,27,（一）样品 1.溶血 2.抗凝剂 3.样品存放的时间和温度 （二）测定条件 1.温度 2.pH 3.缓冲液的性质,影响酶活性测定的因素,
