血清学诊断技术教材课程

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1、,鸡病血清学检验,一 原 理 许多病毒具有凝集动物红细胞的能力, 这种凝集能力可被相应的抗体所抑制, 故可用已知病毒检测相应的血凝抑制抗体 . 也可以用已知标准抗体对分离的病毒进行鉴定.,红细胞凝集抑制试验,二 使用范围 新城疫、 禽流感、 减蛋综合征、 鸡毒支原体、 滑液囊支原体等病原微生物感染后的抗体检测；或相应病原分离后的鉴定,三 器材 1.血凝板、 2.微量移液器 3.标准抗原 4.1%红细胞悬浮液 5.被检血清 6.稀释液,2.采血 取健康鸡翅静脉或心脏采血，(按阿氏液2份，血液1份） 注意:(1). 两只健康的鸡血混合; (2). 阿氏液的量要够,3. 红细胞悬液的配制： 将血液注

2、入离心管中，经3000转/分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的细胞加稀释液（生理盐水）洗涤，再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟，充去上清液，再加稀释液洗涤， 如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按1%的稀释度加入稀释液（1毫升红细胞泥加99毫升稀释液）。,(二)被检血清 将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微量法可用孔经2-3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。 注意: 每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。,(三） 血凝抗原效价测定 （操作量25ul） (1)抗原 一般以鸡新城疫I

3、I系或Lasota系作为已知抗原。 来源: 1).购买: 目前也有用聚乙二醇使Lasota系病毒液浓缩，作 成稳定浓缩抗原，HA效价达1：5000以上，4半年 不变。,2) 自制: A. 用鸡新城疫II系或者Lasota系疫苗接种鸡胚制备抗原： B. 疫苗用灭菌生理盐水稀释10倍，以0.1毫升接种于10日龄的鸡胚尿囊内; C. 凡接种后72-120小时内死亡的鸡胚，且病变显著者，分别收获鸡胚尿囊液于消毒试管内，如有血细胞应离心（2000转/分钟）15分钟，取上清液; D. 作HA试验，其凝集价在1：640以上的鸡胚鸡，分装于洁净干燥的青霉素瓶中，保存于冰箱备用。,2.抗原血凝价的测定 每种抗原

4、做两排，结果取均值 1). 1-12孔加生理盐水25ul 2). 第1孔加抗原25ul，反复吹打10次吸取25ul到第2孔，依此类推倍比稀释至第11孔 3). 最后从第11孔吸取25ul弃去,第12孔做生理盐水对照 4). 所有孔加25ul 1红细胞 5). 将血凝板振荡1分钟,6 新城疫病毒室温（1822）作用 30分; 禽流感病毒37作用30分.夏季结果出现快，冬季较慢 新城疫病毒时间长，温度高易发生洗脱 7 结果判定 1).完全凝集孔为终点 2).将血凝板成45角竖立观察 3).红细胞呈泪滴状沉淀为不凝集 4).孔底没有红细胞沉淀,红细胞均匀平铺于孔底为凝集,此孔稀释倍数为1个工作单位,

5、鸡新城疫红细胞凝集试验（HA试验） (过程图),注意 能使鸡红细胞完全凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。如上例，病毒病的HA效价为1：320。,（四) 红细胞凝集抑制试验 1. 抗原准备（工作浓度的准备 ） 红细胞凝集抑制试验（HI试验）时，病毒抗原液25ul内需含4个凝集单位，所以，应将原菌抗原毒作成320/4=80倍稀释。,2 操作步骤 (1) 每孔加25ul的稀释液: 第1孔加25ul待检血清，反复吸吹10次; 吸取25ul于第 2孔，以此类推倍比稀释至第11孔; 最后从第11孔取2 5ul弃去,第12孔为抗原对照; (3) 每孔加4单位抗原;室温下( 18-22

6、)作用30分 (4) 取1红细胞25ul加于各孔中 (5) 将血凝板振荡1分钟 (6) 室温作用30-45分钟（禽流感 37）观察结果 (7) 结果判定 将血凝板呈45竖起观察 完全抑制孔红细胞呈泪滴样下沉,此孔为抑制终点.,鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（H试验） (过程图),放室温作用分钟,单位：l,3.结果报告 (1).鸡的免疫临界水平。 (2).鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价（log2） 的平均值表示的。 (3).检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，。 (4).大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于 0.1%-0.5%，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为 理

7、想的抽样率应为2%。 (5）.鸡群接种新城疫疫苗后，经2-3周测血清中的HI抗体效 价若提高2个滴度以上，表示免疫应答良好，疫苗接种 成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。,琼脂免疫扩散试验（AGP）,一 原理 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中,可以向四周扩散,当抗原抗体扩散到适当比列处相结合,出现肉眼可见的沉淀线. 常用已知抗原检测相应的抗体,适用范围 ( 琼脂扩散试验适用) 禽流感、 传染性支气管炎 传染性法氏囊病、 传染性喉气管炎 鸡痘、 马立克氏病、 传染性脑脊髓炎 网状内皮组织增生症、 病毒性关节炎 多杀性巴氏杆菌病的抗体检测。,三 器材,琼脂扩散板（平皿）;打孔器、 移液

8、器;0.01M PH 7.2 的磷酸缓冲液;琼脂粉（糖）,四 操作程序 （一）琼脂板制备 1 琼脂粉1g 磷酸盐缓冲液100ml 2 加热煮沸， 摇动烧瓶使琼脂粉溶解 3 加入8g氯化钠振荡烧瓶，使氯化钠溶解， 4 待琼脂稍凉不烫手，倒板厚度为2.53mm 5 琼脂凝固后，将其倒置湿盒内，4保存备用,（二） 打孔 1 用打孔器按7孔梅花图案打孔 孔径为3mm-4mm,孔距为3mm 大平皿可打六组梅花孔 2 打孔后用7#针头挑出孔内琼脂 3 最后在酒精灯上烧烤封底,（三） 加样 1 中间孔加抗原 2 外周孔加血清 1、4 孔加阳性血清; 其他 孔加待检血清; 加样至满孔为止; 3 室温下放置10

9、20分钟 使孔内液体扩散完毕或液面下降 4 将琼脂板倒置于湿盒内 37温箱内作用24-72小时观察结果,五 结果判定 （一） 当阳性血清与抗原孔之间出现清晰沉淀线 证明实验成立 （二） 如果被检血清与抗原孔之间出现沉淀线 或阳 性血清的沉淀线向邻近被检血清孔内侧偏弯者，被检血清判为阳性 （三） 如果被检血清孔与抗原孔之间没有沉淀线;而且阳性血清孔沉淀线直向被检血清孔则被检血清判为阴性,血 清 平 板 凝 集 试 验,一 原理 细菌性颗粒抗原与相应的抗体结合,在适当的电解质参与下, 经过一段时间抗原颗粒相互凝集成肉眼可见团快. 常用已知细菌性抗原检测相应的凝集抗体 凝集试验包括：试管凝集反应 、

10、平板凝集反应全血平板凝集反应、血清平板凝集反应）.,适用范围 鸡白痢、鸡伤寒 鸡毒支原体、滑液囊支原体 鸡副嗜血杆菌病（鸡传染性鼻炎）,三 器材 凝集抗原、阳性、阴性血清 被检血清，移液器（550ul） 载玻片，25灯箱,四 操作程序 （一）准备 试验前20分钟自4冰箱取出抗原; 阴、阳性血清和被检血清; 使其达到室温，并将抗原液振荡均匀,（二）试验过程 1. 取抗原液25ul滴于载玻片上 2 . 迅速在抗原液上滴加等量的被检血清 3. 快速用牙签将血清与抗原混匀 4. 并涂布成 2cm大小的片状 5. 在灯箱附近不断晃动玻片2分钟，观察有无凝集,五 结果判定 2 分钟内出现明显凝集（背景透亮

11、）为阳性;背景均匀一致呈混浊样，无凝集者为阴性.,阴性,阳性,鸡白痢沙门氏菌的平板凝集试验的观察,新城疫病毒、 禽流感病毒的分离和鉴定,一 病料的采集和处理 活动物： 气管、喉头、呼吸道分泌物（拭子） 死动物 ： 肝、脾、肺等内脏用生理盐水（肉汤） （含双抗2000单位/ml） 制成12组织匀浆 4冰箱作用小时或过夜 转分 离心分钟 取上清液备用,二 鸡胚接种 1 取9-11日龄SPF鸡胚，每个样接种5-10个鸡胚 2 取上述处理的上清液0.2ml 接种于鸡胚尿囊腔中 3 37培养4-7天 4 每天照蛋2次，弃去24小时内死亡鸡胚 5 收集死胚及培养结束时的活胚 放4冰箱中冷却2小时以上（过夜

12、） 6 收取尿囊液测定其HA活性（效价） 阴性者需传代2次,三 病毒鉴定 禽流感病毒与其他血清型的副粘病毒 以及某些细菌支原体也具有血凝性 可用相应特异阳性血清进行血凝抑制试验 或全血平板凝集抑制试验进行鉴定 新城疫血凝抑制试验禽流感 琼脂扩散试验不同血清型禽流感血凝抑制试验,四 新城疫病毒、禽流感病毒的致病力测定 （一） 鸡胚平均致死时间（MDT）（最小致死量） 1 将新鲜感染尿囊液进行101-109稀释 2 每个稀释度接种5枚911天 SPF鸡0.1ml/胚 3 置37培养。每日照蛋2次 4 连续观察7天，记录每个鸡胚死亡时间 最小致死量为引起所有鸡胚死亡最大稀释度 MDT最小致死量引起鸡

13、胚死亡平均时间 强 毒60小时 中等毒力61-90小时 低等毒力90小时,（二） 脑内致病指数（IICP） 1、取凝集价在24以上的新鲜感染尿囊液 用生理盐水10倍稀释； 2、脑内接种1日龄雏鸡（24-40小时） 10只， 每只0.05ml； 3、 每24小时观察一次，共观察8天； 4、 每天观察给鸡打分，正常鸡为0分； 病鸡为1分；死鸡为2分；鸡每天观察仍记录2分） IICP是每只鸡8天所有观察数值的平均数强毒力病毒ICPI为2，温和毒数为0,(三） 静脉致病指数（IVPI） 1 将HA高于24的新鲜感染尿囊液 用生理盐水做10倍稀释 2 给10只6周龄SPF鸡静脉接种0.1ml 3 每天观

14、察一次，共10天，每次观察记录正常鸡为0，病鸡1， 瘫痪鸡、有神经症状者为2， 死鸡记作3（死鸡以后每天仍记3） IVPI指每只鸡10天内观察值的平均数， 温和型和中等毒力者IVPI为0，强毒株为3,禽脑脊髓炎病毒 的分离和鉴定,一 采样 （一） 取发病典型的雏鸡脑组织 （发病早期，不超过23天） 加含双抗的生理盐水制成1020悬液 （二） 4作用24小时， （三） 1500转离心30分钟，取上清液备用。,二 鸡胚接种 1 取5-7日龄SPF鸡胚5-10枚 2 卵黄接种 将鸡胚垂直放于蛋托上 3 在气室中央打孔， 用7#针头垂直插入剩下1cm左右 4 接种0.2ml病毒液，封蜡 5 37继续孵

15、化11天12天，观察结果,三 结果判定 1 自然感染的野毒不易使SPF鸡胚出现病变 需要传34代才能适应鸡胚出现病变 . 2 取半数鸡胚打开观察鸡胚观察 肌肉营养不良，腿肌运动性降低 脚趾弯曲等变化 3 另一半鸡胚继续孵化 出壳后10天内便可见到典型AE症状出现,四 病毒鉴定 1 将出现病变的鸡胚（脑、胃肠道、胰腺） 通过一定的方法制备成琼扩抗原 2 用已知的阳性血清与之做琼脂试验 检测病料（脑，胰脉，胃肠）中的AEV,五 鸡胚敏感试验 方法同鸡胚AEV分离 目的是检测鸡群的免疫效果 取待检鸡群种蛋（鸡胚）20枚 接种鸡胚适应毒株Van Roeckl 100EID 每只鸡胚0.2ml 100EID,六 结果判定 1 所有鸡胚均出现特征病变 待检鸡群为敏感鸡群没有免疫力 2 70100%鸡胚无病变 鸡群对AE具有很强的免疫力 3 50%以内的鸡胚无病变 鸡群