《项目2微生物发酵技术任务微生物菌种筛选与保藏讲解材料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《项目2微生物发酵技术任务微生物菌种筛选与保藏讲解材料（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、项目2：微生物发酵技术 任务1：微生物菌种筛选与保藏,教学安排： 1. 员工培训 由老师讲解理论基础。 分配实操任务(菌种筛选与保藏)。,2. 学生模拟组建运营一个菌种保藏服务机构，撰写计划书(在理论教学期间完成)。 市场部：菌种保藏的适用范围，市场需求调查，服务推广方案。 技术部：保藏技术的选择、制定相关技术的操作规程。 品控部：制定菌种保藏质量的标准及检测方法。 总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。,3. 计划书实施。 计划书要先经过老师的审核，然后实施。 实施过程中考核操作技能。 实施后及时进行实训报告的撰写也总结。,选育方法： 1 自然选育； 2 诱变育种； 3 原生质体技
2、术； 4 杂交育种； 5 分子生物学方法。,第一节 自然选育 自然选育是一种纯种选育的方法，纯化复状之功效，也可选育正突变株。 一 菌种退化与变异的原因 1 遗传基因型的分离； 2 自发突变的结果； （1）用沙土管长期保藏； （2）菌种连续传代； （3）活细胞内的新陈代谢；,（4）DNA中存在增变基因； （5）DNA的代谢失调。 3 经诱变剂处理后的退化变异,二 自然选育的方法,1 单孢子悬浮液的制备； 2 分离及单菌落培养； 3 筛选；,第二节 诱变育种 一 突变诱发过程 （一）诱变剂接触DNA分子前； （二）DNA损伤的修复； 1 光复合修复； 2 切补修复； 3 重组修复； 4 SOS修
3、复系统； 5 DNA多聚酶的校正作用。,（三）从前突变到突变 经过修复系统后继续保留的突变。 增强诱变效果的方法： 1 抑制修复的酶系统； 2 使诱变的基因处于活性状态。 （四）从突变到突变型 表型延迟： 表型的改变落后的基因型的改变。 1 分离性延迟； 2 生理性延迟。,二 诱变育种方案的设计 （一）制定筛选目标 高产性状再加辅助目标。 （二）制定筛选方案 1 诱变过程 （1）出发菌株斜面； （2）单孢子悬液制备； （3）孢子计数； （4）单菌落分离。,2 筛选过程 （1）传种斜面； （2）留种保藏； （3）筛选高产菌株。 三 突变的诱发 （一）出发菌株的选择 （1）选择纯种； （2）选择具
4、有优良性状的出发菌株；,（3）对诱变剂敏感。 （二）诱变剂的选择 （1）多种诱变剂轮换使用； （2）最适剂量。 （三）影响诱变效果的因素 （1）菌种的生理状态； （2）处理前后的培养条件。,四 突变株的筛选,(一)随机筛选 1 摇瓶筛选法 优点：培养条件与生产条件相接近； 缺点：工作量大，时间长，操作复杂。 2 琼脂块筛选法 优点：操作简便、速度快； 缺点：固体培养与液体培养差距大，不能准确反应生产能力。,3 筛选自动化与筛选微型化 （二）理性化筛选 运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调
5、控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。,1 初级代谢产物高产菌株的筛选； （1）降低终产物浓度 筛选终产物营养缺陷型； 筛选细胞膜透性改变的突变株。 (2)筛选抗反馈调节突变株 筛选结构类似物抗性突变株； 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株。,2 次级代谢产物高产菌株的筛选 次级代谢产物产生的条件： 共同的前体与营养不平衡。 (1)利用营养缺陷型筛选 芳香族氨基酸与氯霉素有共同的凝胶体莽草酸，选育芳香族氨基酸缺陷型，有利于积累氯霉素。 脂肪酸与制霉菌素、四环素、灰黄霉素有共同的前体丙二酰CoA。 渗漏缺陷型：遗传性障碍不完全的营养缺陷型。,(2)筛选负变株或零变株的回复突变株 (3)筛选去磷酸盐
6、调节突变株 筛选能在磷酸盐抑制浓度下，正常产生抗生素的突变株； 筛选磷酸盐结构类似物抗性突变株。 低亲和力的磷酸盐转运系统I； 高亲和力的磷酸盐转运系统II。 (4)筛选去碳源分解代谢调节突变株 解除葡萄糖效应(去葡萄糖分解代谢调节突变株毒性结构类似物抗性突变株)。,筛选淀粉酶活性高的突变株。 (5)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 许多抗生素和氨基酸有共同的前体或者有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体。 例：半胱氨酸和缬氨酸是青霉素母核。 (6) 筛选二价金属离子抗性突变株 (7) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 前体或前体结构类似物对菌体生长有抑制作用。,前体：自身不能合成； 自身能合
7、成，但产量低； 自身能合成，但有反馈调节作用。 (8)筛选自身所产的抗生素抗性突变株,第三节 生产菌种的保藏,一、菌种保藏的目的与原理 二、菌种的复壮,一、菌种保藏的目的与原理,(一) 原理 人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。,菌种保藏,菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。微生物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养物质等，如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。,菌种保藏,其中低温是保藏菌种的重要因
8、素，也是常用的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。,(二)、菌种保藏,(一)低温保藏法 (二)低温定期移植法 (三)液体石蜡封存保藏法 (四)固体曲保藏法 (五)甘油管保藏法 (六)真空冷冻干燥法 (七)液氮超低温保存,现行的菌种保藏方法有下列
9、诸种:,(一)低温保藏法,这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4冰箱内保藏，这种温度条件下不能使菌体进入休眠，而仅是抑制微生物的生命活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不超过13个月为宜。本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。,(二)低温定期移植法,把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植，一般36个月移植一次(视菌种特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是将含0.60.8的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接
10、种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年以上不发生明显变异。,(二)低温定期移植法,斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，即容易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。,(三)液体石蜡封存法,本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-44下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。,(三)液体石蜡低温封存法,具体操
11、作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121高压蒸汽灭菌12h，将其放烘箱中(160左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。,(四)干燥保藏,微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥，所用载体有
12、沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。,1.沙土管法,取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10盐酸浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm，直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞121灭菌1h，也可用1702h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液(106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.30.5ml，用接种环将其混合均匀。,1.沙土管法,也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直
13、接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4下保存。从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。,1.沙土管法,在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种存活率的关系见图2-10。 用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。,1.沙土管法,2.滤纸保藏法,本法是将要要保藏的微生
14、物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。其方法是3#滤纸剪成5mm50mm的小条，放入干燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。,3.大(小)米保藏法,是根据我国制曲原理加以改进的一种方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的菌直接培养在大(小)米培养基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。,(五)甘油管保藏法,本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌
15、种用无菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(1081010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为40%，于-20下冻存。,(六)真空冷冻干燥法,真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。,(六)真空冷冻干燥法,冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微
16、生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细甩悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。,(六)真空冷冻干燥法,1.冷冻干燥的基本原理 即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。 2.设备 冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制温度范围为-4040。,(六)真空冷冻干燥法,3.操作方法 (1)安瓿管准备 选取规格约直径为8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡810h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗23次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。,(六)真空冷冻干燥
