《全封闭式单胞藻连续培养系统营养盐的添加次数对其生长影响》-公开DOC·毕业论文

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1、河北农业大学海洋学院毕业论文全封闭式单胞藻连续培养系统营养盐的添加次数对其生长影响 （河北农业大学海洋学院水产科学系本养06班）摘 要 本文研究了在全封闭式单胞藻连续培养系统中培养扁藻时营养盐添加量的添加次数对其生长的影响，结果表明：分次加人营养盐比一次性加人的方法好。因为这样可以使营养盐浓度差别小，环境条件稳定，又能满足单胞藻类所需要的营养，有于单胞藻的生长发育。关键词：扁藻 封闭式养殖 营养盐添加量 单细胞藻生活在海洋和湖泊中,是地球上最早出现的能利用太阳光能和无机物制造有机物的原始低等植物。单胞藻在水体中具有多种作用:一是作幼体基础饵料;二是经光合作用能增加水体溶解氧;三是能降低水中的氨

2、氮,稳定水质,维护良性生态循环。正常情况下,扁藻培养液呈翠绿色,有沉降性和附壁现象,必须连续充气。单胞藻可直接进行光合作用,营养成分全面,特别是微量元素、维生素和高度不饱和脂肪酸(HUFA)含量丰富,培养成本便宜,生长繁殖迅速,且具有对环境适应性强和易培养等特点,是水产动物特别是贝类、甲壳类幼体的优质适口饵料。同时在现代农业的高集约化、高效率的养殖模式下,单胞藻还可净化水质,除去养殖水体中的废物,促进养殖水的循环利用,所以具有高度开发意义。而本文研究的全封闭式单胞藻连续培养系统相比较传统的养殖模式有很多的优点,如下:1培养的密度大,传统的水泥池养殖小型的单胞藻密度达到30万左右,而新型的养殖模

3、式在150到300万左右.2养殖过程中污染小,可以实现连续培养,将空气进行过滤消毒处理养殖效果会更好.3便于规模化的养殖,单位体积的藻液密度大,由于现在专业化生产单胞藻的工厂越来越盛行,所以单胞藻的浓缩技术很重要,而这种养殖模式的藻种密度大使得浓缩工作方便易行.然而传统的养殖模式其参数相对固定比较成熟比如营养盐的添加量,接种的密度以及营养盐的添加次数,而本文研究的这种新型养殖模式在这些方面还有空白. 虽然密度可以达到传统模式的5倍但是添加量并不是呈这个倍数的, 为了缩短单胞藻的生产周期，提高单位时间内的产量，提高单胞藻连续培养系统的利用率，必须确认最适合于单胞藻生长的营养盐浓度及添加量来指导生

4、产。本实验的目的即为确定最适于单胞藻扁藻生长的康威培养液浓度的添加次数。1材料与方法1.1实验材料和化学药品1.1.1藻种来源：秦皇岛昌黎陈永利研究所 扁藻1.1.2试验药品：海水消毒药品：含氯5%的漂白液，Na2S2O3营养液的配方：FeCl3.6H2O, MnCl2.4H2O, H3BO3 ,EDTA-Na2, NaNO3, Na2HPO4,蒸馏水氨氮测定药品：NH4N标准液，柠檬酸钠溶液，NaOH，苯酚，NaclO测定叶绿素药品：90%丙酮，1mol/LHcl密度测定：碘液1.1.3试验仪器： 721型分光光度计，Olympus生物显微镜，锥形瓶，移液管 ，量筒，玻璃棒，烧杯研磨钵，比色

5、管，抽滤泵，离心机，抽滤装置1.2试验准备1.2.1试验仪器准备封闭式养殖模式设备 制袋的材料和方法采用周长30cm，长度约95cm的农用聚乙烯透明塑料薄膜袋，两边分别连接与培养设备，下面安装一个充气石，作充气用，以此作为培养的容器。共八个，吊至下离地一厘米左右。海水消毒向薄膜袋内注人用含有效氯的百分之七的NaCIO消毒灭菌的海水，24小时后，以Na2S2O3中和，解毒。培养液的配制方法：本试验培养液采用康威配方甲液，其配制方法如下表所示表1康威培养液的配方组分含量组分含量FeCl3.6H2O1.3 gNaNO3100gMnCl2.4H2O0.36g Na2HPO420gH3BO333.6 g

6、EDTA-Na245g蒸馏水1000ml1.3试验设计藻种接种到聚乙烯透明塑料薄膜袋中进行一次性培养。接种浓度约为10104cellsmL-1。培养过程中连续充入空气,维持二氧化碳的供给，育苗室上顶为玻璃钢瓦光照条件由自然光照和日光灯保证。分为四种添加方法，并分别有一个平行组。八个立柱是相互独立的,这样有利于对各个添加方式进行对比分析。培养液中营养盐的添加按下表所示表2四组培养液中营养盐的添加方法16日17日18日19日20日21日22日23日一次添加60ml分两次添加30ml30ml分四次添加15ml15ml15m15ml分八次添加7.5ml7.5ml7.5ml7.5ml7.5ml7.5ml

7、7.5ml7.5ml每水平平行2组(背光组和向光组)。1.4指标的测定及方法1.4.1密度测定法：每隔一天在同一时间(下午2:00)测定藻种密度1次。藻种密度用XB一K一25型血球记数板计数，用血球计数法【1】在显微镜下计数以观察扁藻的生长情况。每次每样品计数3次，取平均值作为结果。1.4.2测定起始及终止的氨氮含量（选用721型分光光度计）。1.4.3测定叶绿素的含量。下面简述一下叶绿素的测定方法：叶绿素a是整个光合作用过程中能量传递中心，因此，人们主要以叶绿素a值作为浮游植物现存量的指标。由于叶绿素测定法比计数法更能客观地反映水体中浮游植物的现存量，而且简便和快捷，目前已成为一个常用的测定

8、浮游植物现存量方法。同时，叶绿素值通过一定换算，也可指示初级生产量的大小。试剂1、丙酮溶液（CH3COCH3）=90，分析纯：量取丙酮（CH3COCH3）=99.5%化学纯900ml，用水稀释至1L。2、乙醇（C2H5OH）=90，分析纯：量取无水乙醇（C2H5OH）=99.5%900ml，用水稀释至1L。3、碳酸镁（MgCO3）：1%（10g/L）碳酸镁悬浊液，称取1g碳酸镁（MgCO3），加水至100ml，搅匀，盛于试剂瓶中待用，用时需再摇匀。4、盐酸溶液c（HCl）=1moLL-1到比色皿中，在510min内再次测定750nm和665nm处的光密度值。5、滤膜：玻璃纤维滤膜Whatman

9、 GFC或相应的混合纤维酯微孔滤膜。仪器与设备1、分光光度计。2、抽滤装置：砂芯过滤活动装置（直径50mm），抽滤瓶、负压表、真空泵等。测定步骤1、水样的采集：采取水样25ml或者50ml 2、抽滤3、提取：用的是丙酮4、离心 5、光密度测定：在光径为2cm的比色皿中读取波长为665nm和750nm处的光密度。加1滴盐酸溶液c（HCl）=1moLL-1到比色皿中，停留1min后在5min内再次测定750nm和665nm处的光密度值【2】。结果计算C（Chla）=（Eb-Ea）R/（R-1）kVe/VIPa=（REa-Eb）R/（R-1）kVe/VI式中：C（Chla）水样中叶绿素a的含量，mg

10、m-3或gL-1；Pa水样中脱镁色素的含量，mgm-3或gL-1；Eb提取液酸化前波长665nm和750nm处的光密度之差；Ea提取液酸化后波长665nm和750nm处的光密度之差；R最大酸比，即不含脱镁叶绿素的纯叶绿素a提取液在酸化前后光密度比值，R=EbEa，目前采用R值为1.7；Ve提取液的总体积（10ml）V抽滤的水样体积（L）；I比色皿的光径(cm)；K叶绿素a在665nm处的比吸光系数的倒数乘以1000。根据目前资料，比吸光系数在丙酮中一般取89；在乙醇中取87，在无水甲醇（CH30H）=100，分析纯中取77，故K值相应为11.24、11.49和12.99。因公式中R和K值为已知

11、，如用丙酮作提取液，比色皿光径为1cm，则上述计算公式可简化为：c（chla）=27.3（Eb-Ea）ve/VPa=27.3（1.7Eb-Ea）ve/V【3】分光光度法测定叶绿素浓度值极限为1gL-1，如果水中叶绿素含量极低（如贫营养型湖泊、水库和海洋），则要用荧光法测定，它的灵敏度至少比分光法要提高10倍。测定结果用gL-1或mgm-3表示。2结果与分析2.1温度温度对扁藻的生命活动有重要的影响，一面通过控制光合作用或呼吸作用强度，直接影响扁藻的增殖。另一方面，可通过控制水体中各类营养物的溶解度、离解度或分解率等理化过程间接影响扁藻的生长。 表3：扁藻生长期间的温度 ()17日 18日19日

12、20日21日22日最高202015252525最低8898131323日24日25日26日27日28日最高262927262526最低1412.5131613142.2 以相同密度的扁藻藻种接种，前几天的密度增长变化幅度不大，藻种的颜色也基本一致，但随着扁藻的不断增值，从水体的颜色看各浓度组的藻种密度有了不同。可藻种的密度不能用肉眼取区分，更不能确定其中的密度的具体大小。用血球计数法计数可给扁藻较准确的定量。 表4不同营养盐添加次数下扁藻的生长密度（万/ml）一次两次三次四次起始10101010第二天34514125第四天16131718第六天28281519第八天 42756456第十天17

13、610898156第十二天155155140185第十四天205162145148注：表中数据为两平行的平均值。 扁藻的生长密度是生长状况的最好反映，可以反映出生长所处的时期以及生长状况的差别，为了更还好的直观的看出扁藻在各个添加次数组的生长情况做了下面的模拟图加以诠释。图1不同营养盐添加次数下扁藻的生长密度2.3以叶绿素a值作为浮游植物现存量的指标分析扁藻的生长状况由于叶绿素测定法比计数法更能客观地反映水体中浮游植物的现存量，而且简便和快捷，目前已成为一个常用的测定浮游植物现存量方法。下图为扁藻生长期是叶绿素a的测量结果.表5, 不同营养盐添加次数下叶绿素含量（单位gL-1）17日22日25

14、日28日一次0.076440.698881.190281.39776两次0.141960.240240.043681.55064四次0.152880.425880.120120.93912八次0.240240.38220.775320.57876 注：表中数据为两平行的平均值。为了更好的直观的看出扁藻在各个添加次数组的生长情况做了下面的模拟图加以诠释。图2不同营养盐添加次数下叶绿素含量（单位gL-1）3讨论1）封闭式培养单胞藻与传统的培养方式比较效率高的原因:首先由于采用的是农用聚乙烯透明塑料薄膜袋，四面受光，透光率高，而传统的培养方式是使用水泥池，只有池面表层光照比较强，而其他的部位藻类的光合作用都受到影响。其次在温度的控制上面封闭式的养殖方式比较容易控制，只要控制好室温就可以保证塑料膜中培养液的温度，而传统方式，培养池水温控制就很不容易加温难度大。最后最重