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1、,学 海 无 涯 TaqDNA 聚合酶 PCR 技术出现初期，DNA 聚合酶应用的是大肠杆菌 DNA 聚合酶的Klenow 片段。由于该酶不能忍受反应 循环中解链所需的高温(9395)，因此在反应过程中必须不断添加聚合酶以满足每次扩增的需要；另一方面， 由于 K1enow 片段聚合反应温度偏低(37)，容易引起引物与 DNA 模板的非专一性配对，或受某些 DNA 二级 结构干扰，结果产生许多非均一性的产物区带。 耐热 DNA 聚合酶引入 PCR 后，使其操作大大简化，克服了用 K1enow 酶每一循环中反复追加酶的缺点， 并成为 PCR 自动化和迅速应用于分子生物学和其他学科的促进剂。 目前，
2、PCR 耐热 DNA 聚合酶中以 TaqDNA 聚合酶应用最广泛。该酶是从水生栖热菌(Thurmus aquaticus， 简称Taq)株中分离出来的。 一、酶活性与热稳定性： Gelfoad 等于 1989 年总结出 Taq 酶的合成速率如下。 7580 150s 70 60s 55 24s 37 15s 22 025s 可见在一定范围内，温度越高，Taq 酶的合成速率越高。 温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响 Taq DNA 聚合酶的活性，该酶虽然在 90以上几乎无 DNA 合成， 但确有良好的热稳定性，在 PCR 循环的高 温条件下仍能保持较高的活性。 TaqDNA 聚合酶具有
3、 5-3外切核酸酶活性。如果模板上有一段退火的不能延伸的寡聚核苷酸“阻 断物”时，它会被此外切核酸酶活性逐个切除而不会阻止来自上游(3OH)的链的延伸；Taq 酶无 3一 5 外切核酸酶活性 TaqDNA 聚合酶还具有反转录活性，类似于反转录酶。在 23mmolLMg2，68C 时即能发挥此 活性。有学者报道该酶在 Mnz+存在时，反转录活性更佳，没有 Mn2+时不能反转录 150250bp 以上的核酸片 段。这一特性可直接用于RNA 的扩增，使其简化。 TaqDNA 聚合酶具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的功能，可在新合成双链产物的 3端加上 一个碱基。尽管 4 种碱基均可被聚合到
4、3端，但Taq 酶对 dATP 的聚合能力远高于其他 3 种 dNTP.所以，在标 准 PCR 条件下，PCR 产物 3端这一非模板依赖的聚合碱基几乎总是A。 TaqDNA 聚合酶可在-20储存至少 6 个月。 二、TaqDNA 聚合酶的应用条件： TaqDNA 聚合酶的应用条件：需 Mg 2+（1mmol/L）。低浓度 Mn2+（2mmol/L）有低活性。Ca2+使其完全失 活。 一价阳离子高至 0.1mol/L 对其活性无影响最适浓度：NaCl=40mmoL/L KCl =60mmol/L 最适 pH：7.8 三、其作用功能在于，在有 4 种核苷三磷酸盐的反应体系中，以高温下变性的 DNA
5、 为模板，从分别结合 在目的 DNA 两端的引物出发，按 5，一 3方向合成 DNA 新链。产物 dsDNA 再经加热解链，耐热的TaqDNA 聚合酶又在下一轮新股 DNA 链的合成中显示活性。Taq 酶的合成速率取决于温度、Mg2、去污剂、模板的二 级结构、dNTP 浓度等等。 附一：幻灯片内容： TaqDNA 聚合酶简述 TaqDNA 聚合酶是一种耐热 DNA 聚合酶，分子量约为 65000。 该酶最初由极端嗜热水生菌中提取并纯化，目前已能通过基因工程大量生产。 Taq 一般特性：53，外切、反转录活性、末端转移功能、很高的耐热稳定性 Gelfoad 等于 1989 年总结出 Taq 酶的
6、合成速率如下。 7580 150s 70 60s 55 24s 37 15s 22 025s 可 见在一定范围内，温度越高，Taq 酶的合成速率越高。 温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响 Taq DNA 聚合酶的活性，该酶虽然在 90以上几乎无 DNA 合成， 但确有良好的热稳定性，在 PCR 循环的高温条件下 仍能保持较高的活性。 TaqDNA 聚合酶的应用条件：需 Mg 2+（1mmol/L）。低浓度 Mn2+（2mmol/L）有低活性。Ca2+使其完全失活。 一价阳离子高至 0.1mol/L 对其活性无影响最适浓度：NaCl=40mmoL/L KCl =60mmol/L 最适p
7、H：7.8 TaqDNA 聚合酶的应用：TaqDNA 聚合酶主要用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)中，能以,学 海 无 涯 DNA 为模板，需引物引导，以dNTP 为原料，按碱基配对原则，从 5-3方向合成新的 DNA 链。TaqDNA 聚 合酶在 7075时具有最佳的生物活性，随着温度的降低，酶活性明显下降。（在一定范围内，温度越高，Taq 酶的合成速率越高） Taq 在 pcr 中 de 应用 其作用功能在于，在有 4 种核苷三磷酸盐的反应体系中，以高温下变性的 DNA 为模板，从分别结合在目的 DNA 两端的引物出发，按 5，一 3方向合成
8、DNA 新链。产物 dsDNA 再经加热解链，耐热的 TaqDNA 聚合酶 又在下一轮新股 DNA 链的合成中显示活性。Taq 酶的合成速率取决于温度、Mg2、去污剂、模板的二级结构、 dNTP 浓度等等。 附二：离子依赖性 aqDNA 聚合酶是 Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对 Mg2+浓度非常敏感。由于 Mg2+能与 dNTP 结合而影响 PCR 反应液中游离 的 Mg2+浓度，因而 Mgcl2 的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度。一般反应 中 Mg2+浓度至少应比 dNTP 总浓度高 0.51.0mmol/L.适当浓度的 KCL 能使 Taq DNA 聚合 酶的催化活性提高
9、5060%，其最适浓度为 50mmol/L，高于 75mmol/L 时明显抑制该酶 的活性。 忠实性 TaqDNA 聚合酶具有 53聚合酶活性和 53外切酶活性，而无 35外切活 性，它不具有 Klenow 酶的 35 校对活性。因而，在 PCR 反应中如发生某些碱基的错 配，该酶是没有校正功能的。Taq DNA 聚合酶的碱基错 配机率为 2.110 -4. 抑制剂 低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA 聚合酶的 催化活性并无影响。 PCR 技术原理简介： PCR 技术的基本原理是 DNA 的半保留复制。由于 DNA 复制是半保留的，两条链都 可以作为模板。在体内，DNA 复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR 技术在体外利用人工合成的引 物，再加上 DNA 聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使 DNA 不断位于变性、复性和合成的 循环中，达到扩增 DNA 的目的。,
