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1、第二章 蛋白质化学 Chapter Two Protein Chemistry,第一节 通论,一 蛋白质概念及生物学意义 19世纪中期，荷兰化学家Mulder提出，Protein 来自希腊文Protos，翻译成中文： 首要的，第一位的，重要的。In=物质，东西，剂。 1 结构物质 2 功能物质 恩格斯：蛋白质是生命的体现者，没有蛋白就没有生命。,蛋白质主要功能： 催化功能(酶) 调节功能 运动功能 运输和跨膜转运功能 保护和防御功能 信息传递与识别功能 贮存功能 结构功能 二 蛋白质分类 1 根据分子形态 （1）球状蛋白 （ 2）纤维状蛋白,2 根据功能分类 六大类： 催化蛋白类（酶） 结构蛋
2、白类 转运蛋白类 调节蛋白类 信号传递蛋白类 动力蛋白类,3 根据组成分类 简单蛋白质 分子中只有氨基酸 结合蛋白质 简单蛋白+非蛋白成分， 也称复合蛋白质（conjugated protein）或全蛋白质（holoprotein） 结合蛋白根据结合的非蛋白成分进一步分为： 色蛋白（chromoprotein）色素+Pr 血红素蛋白；细胞色素类（蛋白）；叶绿素蛋白；血蓝蛋白；黄素蛋白, 金属蛋白（metalloprotein）金属离子+Pr 磷蛋白（phosphoprotein） 含磷酸基+Pr 核蛋白（nucleoprotein） 核酸+Pr 脂蛋白 （lipoprotein） 脂类+Pr
3、细胞脂蛋白和血浆脂蛋白 糖蛋白（glycoprotein）糖类+Pr 4 根据溶解度分类 有些书上认定为简单蛋白。,清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白 5 根据营养价值分类 完全蛋白；不完全蛋白 蛋白质互补作用 三 蛋白质元素组成 C(52%);O(23%);N(16%);H(7%) 蛋白质系数=6.25（凯氏定氮法）,三聚氰胺（Melamine） 分子式为C3H6N6 ，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。 涂料：用丁醇、甲醇醚化后，作为高级热固性涂料、固体粉末涂料的胶联剂、可制作金属涂料和车辆、电器用高档氨基树脂装饰漆。,第二节 蛋白质的组成单位
4、-氨基酸,发现： 法国化学家H Braconnot 纤维素酸热解-葡萄糖（单体） 明胶酸热解-含氮化合物（甘氨酸） 肌肉酸水解-含氮化合物（含氨基和羧基）-氨基酸 蛋白质的基本组成单位是（*）氨基酸（amino acid，AA）,一 氨基酸的一般结构特征,氨基酸的基本结构特征： 酸性： 碱性： 手性（旋光性）： 特异性,蛋白质是由20种L-型的-氨基酸构成。,非极性氨基酸（6个）,极性不带电荷（6个）,芳香族（3个）,带电荷（5个）,二 氨基酸的分类和结构 1按照氨基酸侧链的极性分类 非极性氨基酸：Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro共八种 极性不带电荷
5、：Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr共七种 带正电荷：Arg, Lys, His（碱性氨基酸） 带负电荷：Asp, Glu（酸性氨基酸）,2按照氨基酸侧链的化学结构 脂肪族氨基酸 共15种。 侧链只是烃链（Gly, Ala, Val, Leu, Ile） 侧链含有羟基（Ser, Thr） 侧链含硫原子（Cys, Met ） 侧链含有羧基Asp（D）, Glu（E） 侧链含酰胺基Asn（N）, Gln（Q） 侧链显碱性：Arg（R）, Lys（K） 芳香族氨基酸 3种 苯丙氨酸（Phe, F）色氨酸(Trp,W) 酪氨酸(Tyr,Y) 杂环氨基酸 2种 组氨酸(H
6、is) 脯氨酸(Pro) 。 （B是指Asx，即Asp或Asn； Z是指Glx，即Glu或Gln。）,3 按照酸碱性分类： 酸性氨基酸：Asp, Glu 碱性氨基酸：Arg, Lys, His 中性氨基酸：15种 4 按照氨基羧基分类 一氨基一羧基；二氨基一羧基；一氨基二羧基,小结结构特点 2酸3碱3芳香2S3OH2酰胺,总结：二十种氨基酸的结构特点 支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸 含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸 含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、 甲硫氨酸（含硫甲基） 含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 含胍基的氨基酸：精氨酸 含咪唑基的氨基酸：组氨酸 亚氨基酸：脯氨酸 含酰胺的
7、氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺 含吲哚基的氨基酸：色氨酸 含-氨基的氨基酸：赖氨酸,三 其他氨基酸,1 两种新发现的氨基酸: 硒代半胱氨酸（Sci 2002.5.24） 吡咯赖氨酸 2 修饰性氨基酸 3 非蛋白质氨基酸,五 氨基酸一般性质,两性离子 光吸收： 最大吸收波长=280nm 苯丙氨酸 257-259nm/257nm 酪氨酸 275-278nm/275nm 色氨酸 279-280/280nm 苯环氨基酸含大键 吸收紫外光 溶解性 （乙醇） 旋光性和独自旋光度,六 氨基酸化学性质,1 两性解离和等电点,氨基酸的等电点（isoelectric point pI） 氨基酸所带正负电荷相等，即静电
8、荷为零时的溶液pH。,等电点计算及意义,公 式 推 导,中性氨基酸 （一氨基一羧基） pI=(pK1 + pK2)/2,酸性氨基酸 （一氨基二羧基） pI=(pK1 + pK2)/2,碱性氨基酸 （二氨基一羧基） pI=(pK2 + pK3)/2,电荷,0,pH,pI,2 氨基酸化学反应,（1） 茚三酮反应 pH5-7；80-100；茚三酮乙醇；蓝紫色化合 物；570nm 定量测定。 脯氨酸；黄色化合物；440nm 定量测定。 （谷氨酰胺、天冬酰胺；棕色化合物）,（2）-氨基参与的反应 成盐反应 酸水解液中以盐酸盐形式存在（碱中金属盐） 与亚硝酸反应 Van slyke氏氨基氮测定原理。 N2
9、一半来自氨基酸，另一 半HNO2。 该反应也用来判断蛋白质的水解程度。, 甲醛滴定,由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。主要是因为没有合适的指示剂。封闭氨基后，使氨基酸的滴定范围变小，易于判断滴定终点。 意义：定量测定；判断反应进程。, 与2，4二硝基氟苯的反应（Sanger反应） 弱碱；干燥；暗处；室温；形成黄色DNP-氨基酸，用乙酸 乙酯抽提，并与标准的DNP-氨基酸作比较。,与苯异硫氰酸（PITC)（Edman反应） 弱碱条件反应；衍生物是无色的，酸性条件下极稳定，可溶于乙酸乙酯，经高压液相即可分析出其N端的氨基酸组成。 生成的肽链比原来少一个氨基酸，可以进
10、行下一轮反应，而不需要彻底水解掉 ，此法是自动氨基酸分析仪的基本原理。,与丹磺酰氯（DNS-Cl）的反应 5-二甲氨基萘-1-磺酰氯 酸水解生成的DNS氨基酸（具有荧光），用乙酸乙酯抽提DNS氨基酸，用色谱法分析或直接用纸电泳或薄层层析法鉴定。,形成Schiff碱 （3）-羧基参与的反应 与醇成酯；与碱成盐（保护羧基）。 （4）侧链参与的反应（氨基酸颜色反应） 米伦反应；福林反应；坂口反应；Pauly反应；乙醛酸反应；半胱氨酸反应,侧链的反应,OH,N,反应名称,3 氨基酸色谱分离法 离子交换色谱法 原理：不同pH下，氨基酸电荷不同。 方法：阳离子交换树脂/阴离子交换树脂 薄层层析 滤纸；羟基
11、磷灰石；二氧化硅等。,蛋白质水解 酸水解 方法： 6MHCl或4MH2SO4，105回流20小时即可完全水解。 优点： 酸水解不引起氨基酸的消旋，完全彻底。 缺点： 但色氨酸完全被破坏，丝氨酸和苏氨酸部分破坏，Asn和Gln的酰胺基被水解。 （3）如样品含有杂质，在酸水解过程中常产生腐黑质，使水解液变黑。,碱水解 用5MNaOH，水解1020小时可水解完全。 特点： 碱水解使氨基酸消旋（碱水解的主要机理是在碱性条件下，氨基酸的键更易断裂。形成外消旋体即DL两种构型的氨基酸等摩尔数存在。氨基酸的消旋作用被中和掉。），许多氨基酸被破坏，但色氨酸不被破坏。ARG可脱氨生成鸟氨酸及尿素。常用于测定色氨
12、酸含量。可加入淀粉以防止氧化。,酶水解 既不破坏氨基酸，也不引起消旋。但酶水解时间长，反应不完全。一般用于部分水解，若要完全水解，需要用多种酶协同作用。,第三节 蛋白质的结构,构象（conformation）： 是指分子内各原子和基团间的相互立体关系，它可以通过单键的相互旋转实现变化，不需要共价键的断裂。 构型（comfiguration） 是指在立体异构体中，由于某种因素的限制取代基或原子在空间上形成的不同取向。需要通过共价键的断裂才能实现不同构型分子间的转变。 蛋白质多种多样，分为初级结构和高级结构,一 蛋白质的一级结构 描述的是多肽连中氨基酸的组成和排列顺序及连接方式。 1 肽键和肽链
13、肽键 (peptide bond) ： 肽链(peptide chain) ： 相关概念：肽、多肽、二肽等,肽键 一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基缩水形 成的酰胺键（共价）键，称为肽键。 特点： 具有部分双键的性质,不可以旋转 肽键比一般的碳-氮键短； 与肽键相连的氢原子和氮原子呈反式；,一级结构中的相关术语： N-端（氨基端、NH2-端） C-端（羧基端、COOH-端） 氨基酸残基 （110或108） 2 肽的结构和命名 习惯：按数量的多少、按来源、按功能 二肽、三肽、四肽等、多肽 系统：某氨基酰某氨基酰某氨基酸 重要的肽（生物活性肽）介绍保健品行业的热点。 3 肽链表达式 从N(O
14、H)到C (H) ，具方向性 三字母符号或单字母符号表示，中间用“”或“-”表示。,-2H,+2H,2GSH GSSG,-2H,+2H,参与氧化还原反应传递氢,GSH的作用,解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,4 一级结构研究 测序前提： 样品必须是均一的(纯度大于97%) 必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内 过程 1.测定蛋白质分子中多肽链的数目 2.拆分蛋白质分子的多肽链 3.断开链内二
15、硫键 4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目 5.鉴定多肽链的N、C瑞残基 6.裂解多肽成小的肽段 7.测各肽段的氨基酸序列 8.重建完整多肽链的一级结构 9.确定二硫键的位置, N末端 测定,二硝基氟苯（DNFB）法：（Sanger法） 肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽黄色DNP-氨基酸,丹磺酰氯（DNS）法： 用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸,苯异硫氰酸（PITC）法：（Edman法） 生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来,氨肽酶法：外切酶，但效果不好,氨肽酶法 氨肽酶是一类外切酶，它从肽链的N末端逐个向里切。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 也会遇到N末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽酶处理。,氨基酸酰肼可以与苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀 Gln Asn Cys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸,羧肽酶法,本方法目前最有效。 从羧基端开始向里逐一水解蛋白质 羧肽酶A：释放除Pro，Arg和Lys以外的所有C-末端残基 羧肽酶B：只水解以碱性Arg和Lys为C-末端的肽键,羧肽酶A可以切割C端除了Lys、Arg、Pro的氨基酸 羧肽酶B可以切割C端的Lys或Arg 但如果倒数第二个氨基酸为Pro两种羧肽酶均不能作用, 二硫键的拆分,氧化法：过甲酸,还原法：巯基化合物还原,
