生物化学(第一章)2教学讲义

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1、第一章 蛋白质化学,胡 疆13987478608,第一节 蛋白质（protein）及其生物学功能,生物化学的基本内容包括： 发现和阐明构成生命物体的分子基础生物分子的化学组成、结构和性质； 生物分子的功能与生命现象的关系； 生物分子在生物机体中的相互作用及其变化规律。,生物信息大分子具有如下特征：,生物分子中最重要的是糖、酯、核酸和蛋白质四类物质 分子量一般都很大 由结构小分子结构单元组成. 顺序排列。 结构复杂：线性信息，三维信息,2、蛋白质的重要生物学功能,3、氧化供能,其他生物学功能：营养蛋白，结构，毒蛋白,第二节 蛋白质的分子组成,一、元素组成,1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋

2、白质还含有少量磷和金属元素。 2、特点：各种蛋白质的含氮量很接均含氮量为16%。 3、定氮法测定蛋白质含量： 蛋白质含量6.25样品含氮量,二、结构单位氨基酸（amino acid）,1、蛋白质的结构单位,D-氨基酸：抗生素，生物碱,Tyr,非蛋白质氨基酸,蛋白质基本结构单位：L氨基酸 氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外 L氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外 氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH 常见氨基酸种类：20种。,小结,2、氨基酸分类：按其侧链R的结构和理化性质分类,非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)： Val, Leu, Ile（支链）；Gly（无旋光异构）；Met（含硫）；Phe

3、（芳香族）；Pro（亚氨基） 极性、中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸) ： Ser, Thr（含羟基）；Tyr, Trp（芳香族）；Cys（含硫）；Gln, Asn（含酰氨）,酸性氨基酸（含有两个羧基）： Glu（含羧基）、Asp（含羧基） 碱性氨基酸（含有两个以上氨基）： Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（氨基）,含硫氨基酸：Met、Cys 芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp,三、氨基酸的理化性质,1、物理性质 2、两性解离 等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨

4、基酸所处环境的pH值称为该种氨基酸的等电点(pI)。,甘氨酸的酸碱滴定曲线,(zwitterion),等电点计算 侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨基酸：pI=(pK1+pK2) 酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=(pK1+pKR) 碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=(pK2+pKR),带电状态判定 pI-pH0 .带正电 pI-pH0 .不带电,等电点的计算,3、紫外吸收：,Trp、Tyr和Phe在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm,氨基酸的化学反应,由-氨基参与的反应 1.与亚硝酸的反应：,Van Slyke定氮法,生产上常用于测定蛋白质

5、的水解程度。,氨基酸的化学反应,由-氨基参与的反应 2.与甲醛反应： 甲醛滴定法,应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.避免氨基的干扰 D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,3.与醛类反应,氨基酸的化学反应,由-氨基参与的反应 4.氨基酰化：氨基保护,氨基酸的化学反应,由-氨基参与的反应 5.二硝基氟苯：黄色，肽链末端分析,应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 A.虽然多肽侧链上的- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与- DNP氨基酸区分和分离 首先

6、由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽 B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,氨基酸的化学反应,由-氨基参与的反应 6.与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成P

7、TH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定 Edman降解法的改进方法- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量,氨基酸的化学反应,由-羧基参与的反应 1.成盐反应,2.成酯反应,氨基酸的化学反应,由-羧基参与的反应 3.酰化反应,4.脱羧反应,显色反应： 茚三酮反应:氨基羧基同时参加反应,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 加热

8、过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,显色反应： 茚三酮反应,茚三酮反应:脯氨酸，羟脯氨酸，黄色物质,例外：Pro黄色；Asn棕色,成肽反应：,第三节 氨基酸的分离纯化,(一)层析技术的原理 俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。,一、层析技术的原理,层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是

9、固定于固体物质上的成分；另一是流动相，如水和各种溶剂。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。,利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。,分配层析（萃取的原理）,A、B两个溶液系统、 I（A:B=2:

10、1） 1g II（A:B=1:3） 1g 第一次萃取后 A中I有2/3g, II有1/4g I:II=8:3 （2.6倍） B中I有1/3g, II有3/4g I:II=4:9 （2.15倍） 第二次萃取后 A中I有4/9g, II有1/16g I:II=64:9 （7.1倍） B中I有1/9g, II有9/16g I:II=16:81（5.1倍）,HPLC:根据出峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离

11、分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。,二、电泳法(electrophoresis),概念：带点质点在电场中与本身电荷相反的电极移动的现象。 氨基酸具有两性解离，PH值决定带电情况。 凝胶电泳 等点聚焦电泳 双向凝胶电泳,三、氨基酸的显色反应,第四节 蛋白质的分子结构,概念,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更

12、大,一、蛋白质分类,生物体内的作用不同 结构蛋白 功能蛋白：活性蛋白、信息蛋白 分子形状分 球状蛋白 纤维状蛋白,一、蛋白质分类,分子组成成分 1.单纯蛋白 (1)清蛋白、球蛋白：水，甘氨酸 (2)谷蛋白、醇溶蛋白：不溶于水 (3)精蛋白、组蛋白：碱性氨基酸，细胞核 (4)硬蛋白：纤维状蛋白，不溶于水、稀酸稀碱和有机溶剂，含大量胱氨酸,一、蛋白质分类,分子组成成分 1.结合蛋白 (1)核蛋白：核酸 (2)色蛋白：辅基是金属色素 (3)糖蛋白：辅基是糖或者糖的衍生物，所有组织，多种功能 (4)脂蛋白：脂肪类脂结合，与脂质代谢、运输 (5)磷蛋白：辅基磷酸。酯键，丝氨酸，苏氨酸羟基结合。酪蛋白,二

13、、蛋白质结构中的化学键,1.肽键 peptide bond（化学键） 2.二硫键 disuffide bond（化学键） 不同肽链，同一肽链不同部位 半胱氨酸 稳定共价键、稳定肽链空间结构 破坏，蛋白质活性丧失。 角蛋白,二、蛋白质结构中的化学键,3.酯键 ester bond（化学键） 丝氨酸、苏氨酸羟基与氨基酸的羧基 磷蛋白：丝氨酸、苏氨酸羟基 维系蛋白质结构，行使功能 4.离子键 ionic bond（库伦作用） 相反电荷的基团 碱性氨基酸，生理条件下 高浓度盐、过高过低PH 羧基PK低，氨基PK高，1-2个PH单位,二、蛋白质结构中的化学键,5.配位键 dative bond（共价键）

14、 金属离子：Fe,Cu,Mn,Zn 高级结构：锌指结构 螯合剂，蛋白质解离成亚基，变形失活 6.氢键 hydrogen bond 氢原子与两个电负性强的原子（F,O,N） 弱键，供体原子、氢、受体原子处在一条直线 氢供体：=NH,-OH,-NH2,-NH3+,-CONH2 氢受体：-COO-,C=O,二、蛋白质结构中的化学键,7.范德华作用力 原子、基团、分子之间弱相互作用 非专一性的吸引力 取向力、诱导力，色散力 与距离6次方成反比，吸引不相碰 蛋白质内部非极性结构，维系蛋白质高级结构 8.疏水作用hydrophobic bond 非极性侧链（疏水基团）在极性溶剂中为了避开水相互彼此靠近所产

15、生的作用力 本质范德华作用力 蛋白质的内部结构中,次级键介导蛋白质高级结构形成,（一）、蛋白质的基本结构形式,1、连接方式：肽键 肽键(peptide bond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。（CONH） 肽平面(peptide unit)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。（CCONHC）,特点： 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 组成肽键的原子处于同一平面。 在大多数情况下，以反式结构存在。,2、肽分类、命名,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺

16、序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,3、生物活性肽： 谷胱甘肽 神经肽：脑啡肽(5)、内啡肽(31-16)、强啡肽(17,9)、P物质、Y肽 肽类激素：催产素、胰高血糖素、促肾上腺皮质激素、加压素等 其他：生长因子；短杆菌肽；青霉素等,二、蛋白质的一级结构 (primary structure),一级结构是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序；主要靠肽键维系。 二四级结构称为蛋白质的空间结构，或空间构象；主要靠次级键维系，尤其是疏水键。,一级结构体现生物信息：20n .多样 一级结构是空间结构及生物活性的基础.特异,（一）蛋白质的氨基酸组成 氨基酸组成的