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1、蛋鸡肠道微生物菌群结构特征与产蛋水平 关联性研究,汇报人：xxx 时间：2017.12.24,一、背景综述,育雏期,育成期,产蛋期,肠道菌群的演变过程,影响肠道菌群演变的主要因素,日龄,环境及日粮,抗生素,益生菌,病原微生物感染,2017.11.19有氧培养第四组,2017.12.19有氧培养第三组,肠道微生物的生理功能,生物屏障功能,营养代谢功能及抑菌作用,免疫功能,促进生长发育功能,肠道微生物的研究方法,变性梯度凝胶电泳技术：能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开。,高通量测序技术：通过扩增 16S r RNA 基因、构建文库，获得大量微生 物种类、丰度、多样性，之后进行相关生物学
2、信息分析。,此实验思路：16S rDNA 是原核生物中编码核糖体小亚基 rRNA 的 DNA 序列，包含 10 个保守区和 9 个高变区，保守区在细菌间差异不大，而高变区则具有种属特异性。因此 16S rDNA 基因是其系统进化分类学研究中最常用的分子标记，广泛应用于微生物生态学研究。通过提取样品中的 DNA，特异性扩增某个或两个连续的高变区，采用高通量测序平台 Hiseq或 Miseq 对高变区序列进行测序，然后通过生物信息学分方法进行序列分析和物种注释，可以了解样品的群落组成情况；进一步通过 alpha 多样性分析可以进一步比较样品之间的差异性。,二、不同产蛋水平蛋鸡粪便菌群结构多样性研究
3、,2.1、材料与方法,试验选取体重相近、正常免疫的 190 日龄海兰褐蛋鸡，饲料营养、管理方式和饲养环境均相同，单笼饲养，自由饮水。连续纪录产蛋 30d 后，选择无腹泻，无绿便，外观健康的产蛋母鸡，根据产蛋水平分别设置为：H 组（产蛋率大于 96%）6 只；L 组（产蛋率在 50%和65%之间）6 只；VL 组（产蛋率小于 30%）3 只。于 220 日龄分别采集每只鸡的新鲜粪样，置-80保存备用。,2.2、试验方法,粪便样品 DNA 提取,16S r RNA 基因 V4V5 区的 PCR 扩增,Illumina 高通量测序,2.3、生物信息学分析,三、结果与分析,3.1粪便微生物基因组 DN
4、A 的提取和 PCR 扩增,由于受盲肠排泄物的影响，粪样存在较大差异，研究选取带有盲肠排泄物的样品，分别提取基因组 DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测合格。,利用 2%琼脂糖凝胶电泳检测 15 个样品中微生物 16S r RNA 基因 V4V5 区 PCR 扩增产物。结果显示 PCR扩增条带大小为 400 bp 片段，与预期片段大小符合。因此，扩增的 PCR 产物可以进行后续高通量测序。,3.2Illumina 测序,3.2.1测序基本数据分析,优质序列即有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。,优质序列比例最高的为样品 L5，达到 80.35%；最低的为样品
5、L2，仅为 56.28%。优质序列的长度主要集中在 393401 之间，与之前 PCR 扩增结果相同。,样本稀释曲线是用来比较测序数量不同的样本物种的丰富度，在5000 条序列时，OTU 数量随序列数增加而迅速增加；在 5 00010 000 条序列时，OTU 数目增加缓慢；之后则趋于平台期。测序结果表明测序量可以覆盖大多数的微生物，并能够反映高产、低产、极低产蛋鸡的肠道微生物菌群多样性组成。,3.2.2丰度分布曲线,丰度分布曲线通常是对各样品的 OTU 丰度大小排序，OTU 的序数作为横坐标，以各个丰度值取 log2的对数值为纵坐标作折线图，可体现环境中物种分布的均匀性。每条折线代表一个样品
6、的 OTU 丰度分布，物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线跨度越大表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。从样品丰度分布曲线横坐标及跨度可以看出，极低产组物种丰度较高，高产组和低产组物种丰度较低。H5、VL1、VL2 三个样品的曲线斜率较小，趋势平坦表明 H5、VL1、VL2 三个样品的物种丰度最高，均匀性最好。,3.2.3Alpha 多样性分析,Alpha 多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性。利用多样性指数来反映样品丰富度和均匀度，主要有 Chao 指数、ACE 指数、Simpson 指数、Shannon 指数等。
7、Chao 或 ACE指数越大，说明群落丰富度越高；由表 3-5 看出，三组 Chao1 和 ACE 指数无差异性，但 H组群落丰富度较高；L 组和 VL 组多样性指数差异显著（P0.05）；丰度接近时，VL 组 Simpson指数较大，表明其群落均匀度较高。,3.2.4不同产蛋水平鸡肠道微生物群落组成比较分析,(1)基于门分类水平进行分析,厚壁菌门在三组中所占比例高于 70%，表明厚壁菌门始终是最优势的门，尤其是在 H 组（88.17%）和 L 组（91.22%）中，厚壁菌门更是构成了绝对的优势菌群，。拟杆菌门属于第二大优势的门（L 组例外），VL 组丰度（15.80%）高于 L 组（1.60
8、%），随着厚壁菌门的增加，拟杆菌门的比例下降。放线菌门是 L 组中的第二优势菌门，其在 VL组所占比例较大（9.53%）。变形菌门在各组中的丰度较低。这些结果表明每个样本在门水平上具有各自的分布特征，这四大菌门总比例高达 99%。,（2）基于属类水平进行分析,结果显示： Lactobacillus（乳杆菌属）在三组蛋鸡粪便微生物中丰度最高。与 H 组和 L 组相比，VL 组乳杆菌属丰度最低（66.05% vs 62.75% vs 20.93%），而肠球菌属（5.58% vs 4.2% vs 8.17%）和拟杆菌属（3.57%vs 0.83% vs 7.6%）及柔嫩梭菌属（0.57% vs 0.
9、28% vs3.4%）比例升高。,四、讨论,1、三组所有样本占优势的门类主要有厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门，这四大菌门总比例高达 99%。在所有的蛋鸡粪便样品中厚壁菌门占绝对优势地位。该门是革兰氏阳性菌中数量最大、种类最多的细菌类群，参与宿主体内的物质和能量代谢过程，在对食物的消化中发挥着重要作用。 2、相对高产组和低产组，极低产组粪便中拟杆菌门和放线菌门的丰度有所升高。 3、高产组中乳酸菌属丰度高于极低产组，这可能是因为乳杆菌是促进肠道健康的重要益生菌，有促进免疫细胞、组织和器官的生长发育，加强小肠和其他组织对病原菌的抵抗力，提高免疫能力的作用。,4、相比较于高产组和低产组，极低产组中稍高丰度的菌属所占比例均不到 10%，而乳杆菌属在三组中都是主要菌属，可能乳杆菌是影响产蛋率的主要微生物之一。 5、柔嫩梭菌属被认为具有很强的抗炎作用，也是丁酸盐的生产者，而丁酸盐能促进肠道上皮细胞对营养物质的吸收，肠道微生物的代谢产物可作为宿主健康与否的标志物。,谢谢聆听,
