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1、革兰氏染色液的配制一、实验试剂：（结晶紫、草酸铵、碘、碘化钾、番红）1. 结晶紫溶液：A液：结晶紫：2g，95%乙醇：20ml。B液：草酸铵：0.8g，蒸馏水：80ml。需在用前24小时将A液. B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用.2. 碘液：碘：1g，碘化钾：2g蒸馏水：300ml。出碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继 续加入少量蒸馏水至完全溶解，最后补足水量。也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。3. 脱色液：95%乙醇。4. 复染液：A.贮存液：番红：2.5g，95乙醇：100ml。B.应用比例：A液：10ml，蒸馏水
2、：90ml。菌片制备：染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环蘸取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布，菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑去菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不易过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。操作步骤：1 涂片将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。2 染色( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，
3、约一分钟，水洗。( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
