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1、葡萄糖氧化酶法 测定血清葡萄糖,实验九,一、实验目的,(1)了解血糖的概念。 (2) 掌握血糖的测定方法葡萄糖氧化酶法。,血糖的来源、去路,血糖水平恒定的生理意义,保证重要组织器官的能量供应,特别是某些以葡萄糖供能的组织器官。 脑组织不能利用脂酸,正常情况下主要以来葡萄糖供能; 红细胞没有线粒体,完全通过糖酵解获能; 骨髓及神经组织代谢活跃,经常利用葡萄糖供能。,测定方法,无机化学法: Folin-Wu法,有机化学法:邻甲苯胺法,酶法:葡萄糖氧化酶法,血糖测定的常用方法,HOW?,方法 类型 原 理 用途及备注 磷钼酸法 定量 G+Cu2+Cu2O 稳定、准确、但对 (Folin-Wu) 分光
2、 Cu2O +磷钼酸试剂 蓝色钼化合物 葡萄糖无特异性, (430nm) 受血中非糖还 原物 质的影响。 邻甲苯胺法 定量 G+邻甲苯胺蓝绿色的席弗(Schiff)碱 较Folin-Wu法特异 (630nm) 但不及酶法。 D-甘露糖能与邻甲 苯胺反应,生成类 似吸收光谱,造成 正误差。,(一)化学法,酶法分析是指用酶作为工具定量测定某种物质含量的分析方法。定量分析的目标可以是酶的底物,辅酶,也可以是酶的激活剂或抑制剂。,(二)酶 法,酶法分析的主要方法: 单酶反应定量法和偶联酶反应定量法,单酶反应定量法:指用一种酶为工具酶定量测定某种物质的方法。 偶联酶反应定量法:当单酶反应底物或产物反应底
3、物或产物的物理化学手段无法区分时,还可以借助另一种酶作为指示酶,通过偶联反应进行定量分析。,方法 类型 原 理 用途及备注 己糖激酶 定量 G+ATPG-6-P+ADP 血清尿液脑脊液、 (HK)法 分光 G-6-P + NADP+ 公认参考方法 动态 GA-6-P + NADPH 操作简便,特异 终点 (340nm) 性和灵敏性均高 推荐常规方法 葡萄糖氧 同上 G+O2 GA+H2O2 化酶(POD) H2O2 + 染料有色染料 偶联法 (还原型) (氧化型) 可制试纸片定量 (Trinder) (4-氨基安替比林+酚 半定量筛选试验 红色琨类化合物505nm),葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法
4、原理,(1)葡萄糖O2H2O,(2)H2O24-氨基安替吡啉苯酚,葡萄糖酸H2O2,葡萄糖氧化酶(GOD),H2O 红色醌式物质,过氧化物酶 (POD),Trinder反应,505nm,光吸收法测定,相对血糖浓度,(1)取3支试管,按下表加入试剂:,实验步骤:,充分混匀,37 水浴中保温20min;,冷却至室温后,505nm处比色,比色方法:以空白管调零,读取标准管及测定管吸光度值。,(2)计算 依据朗伯-比尔定律: A=KLC 血清葡萄糖= (mmol/L) 参考值: 空腹血清葡萄糖浓度:3.896.11mmolL,标准液浓度,注意事项:,本法用血量甚微,操作中应直接加标本至试剂中,再吸试剂
5、反复冲洗试管。 此法可直接测定脑脊液葡萄糖的含量,但不能直接用于测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高,可感染过氧化物酶发硬,造成结果假性偏低。 严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液,然后再进行测定。,临床意义:,生理性高血糖:摄入高糖食物,情绪紧张 病理性高血糖: 糖尿病 内分泌腺功能障碍 颅内压增高 脱水引起高血糖 生理性低血糖:见于饥饿和剧烈运动 病理性低血糖:特发性功能性低血糖,依次是药源性,肝源性和胰岛素瘤等。,调节血糖水平的激素:胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。,思考题:,本实验原理为酶促化学反应,为何未加终止剂终止酶的反应? 本实验涉及显色反应,该反应与血清碱性磷酸酶活力测定中的显色反应有何异同? 为何不同检测方法所提供的空腹正常血糖参考值存在差异? 葡萄糖氧化酶法: 3.896.11mmol/L Folin-Wu法: 4.46.7mmol/L 邻-甲苯胺法: 3.896.11mmol/L,