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1、第3节聚合酶链式反应技术 学习导航1 尝试DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳检测技术 2 说出PCR体外基因扩增的基本原理 一 DNA片段的扩增和琼脂糖凝胶电泳检测1 实验原理 1 变性 温度上升到94 98 双链DNA解旋为单链 2 复性 温度下降到40 60 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 3 延伸 温度上升到72 时 在 酶作用下 四种脱氧核苷酸通过碱基互补配对合成新DNA链2 方法步骤 1 DNA片段的PCR扩增 把混合PCR反应体系的各种药品加入到冰浴的 中 混合均匀后 每管加入30 L无菌石蜡油 TaqDNA聚合 EP管 低速离心 将EP管放入 中 输入并运行反应程序
2、2 DNA扩增产物的检测 制作电泳胶板 配制质量分数为1 的琼脂糖凝胶 制作电泳胶板 加样 在扩增的 中加入 体积的 混匀后 取20 L加入样品孔内 PCR热循环仪 DNA样品 0 2倍 载样缓冲液 电泳 80V稳压电泳20 40min 观察 当溴酚蓝指示剂电泳到 时切断电源 戴好塑料手套 将胶板浸入 溶液中染色5 10min 在紫外透射仪上观察电泳条带 凝胶底部 溴化乙锭 1 PCR技术是体外酶促合成特定DNA片段的一种方法 2 DNA片段扩增所需的引物是DNA 所需的原料是四种核糖核苷酸 3 DNA片段扩增需要加入解旋酶 RNA聚合酶 判一判 二 相关基础知识1 延伸时间和复性温度的选择在
3、PCR实验中 需要扩增的 决定延伸的时间 片段越大 中温延伸的时间就要相应 引物的 和 则决定着 的选择 如果引物越短 含量越多 PCR反应的复性温度越低 反之引物长度 含量较高的引物则需设计较高的复性温度 DNA片段的大小 延长 碱基数量 组成 复性温度 A T 较长 G C 2 PCR技术的衍生技术PCR技术已经衍生出多种DNA检测手段 如随机扩增多态DNA技术 RAPD 单核苷酸多态性 SNP 技术和 AFLP 技术等 扩增片段长度多态性 PCR反应过程中复性温度过高对PCR扩增有何影响 提示 复性温度过高导致引物不能与模板牢固结合 DNA扩增效率下降 甚至引物与DNA模板不能结合 造成
4、PCR扩增反应不能进行 结果是电泳检测不到扩增产物的条带 想一想 1 PCR原理 DNA热变性的原理 2 PCR的反应过程 1 变性 当温度上升到94 98 时 双链DNA解聚为单链 如图 2 复性 系统温度下降到40 60 时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 如图 3 延伸 当系统温度上升到72 左右时 溶液中的四种脱氧核苷酸 A G C T 在DNA聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 如图 特别提醒 1 PCR一般要控制在25 35个循环 每次循环都包括变性 复性 延伸三步 2 两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增 近十年来 PCR技术 多聚酶链式反应
5、 成为分子生物学实验室里的一种常规手段 其原理是利用DNA半保留复制 在试管中进行DNA的人工复制 如图 在很短的时间内 将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍 使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体 1 加热使DNA双链打开 这一步是打开 键 称为 2 当温度降低时 引物与模板 端结合 在DNA聚合酶的作用下 引物沿模板延伸 最终合成两个DNA分子 此过程中原料是 遵循的原则是 3 PCR技术的必要条件 除了模板 原料 酶以外 至少还需要三个条件 即 液体环境 适宜的温度和酸碱度 适宜的温度由 自动调控 酸碱度则靠 来维持 4 DNA的复制需要引物 其主要原因是 A 可加快DNA的复制速度B
6、 引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C 引物的5 端有助于DNA聚合酶延伸DNA链D DNA聚合酶只能从3 端延伸DNA链 思路点拨 解析 1 PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂 称为变性 2 PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样 为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸 鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸 胞嘧啶脱氧核糖核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸 遵循的原则是碱基互补配对原则 引物与模板的3 端结合后 DNA聚合酶才发挥作用 3 PCR技术除了需要模板 原料 酶以外 至少还需要液体环境 适宜的温度和酸碱度 适宜的温度靠PCR仪自动调控 而酸碱度靠缓冲液来维持 4 引物的作用是结合在模板D
7、NA上 提供DNA延伸的起始位点 而DNA聚合酶的作用是从引物的3 端开始催化DNA链的延伸 故选D 答案 1 氢变性 2 3 四种脱氧核苷酸碱基互补配对原则 3 PCR仪缓冲液 4 D 名师点睛 1 加热变性是由于加热使碱基之间的氢键断开 而不是脱氧核糖与磷酸之间的键断开 2 引物的作用是结合在模板DNA上 为DNA延伸提供起始位点 下列有关PCR的描述 不正确的是 A 是一种酶促反应B 反应需要引物C 扩增产量为y 1 x nD 扩增对象是氨基酸序列 变式训练 特别提醒PCR利用了DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解旋与结合 不需要添加解旋酶和ATP PCR过程与细胞内的DNA复
8、制过程相比 主要有两点不同 它们是 PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA PCR过程不需要DNA聚合酶 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 PCR过程中 DNA不需要解旋 直接以双链DNA为模板进行复制 A B C D 解析 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较 主要有两点不同 1 PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA 长度通常为20 30个核苷酸 2 PCR过程中 DNA解旋不依赖解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 答案 C 名师点睛 细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆 特别应注意区分PCR反应需要可变的温度 而体内
9、DNA复制需要稳定的温度 符合PCR技术反应条件的一项是 稳定的缓冲溶液环境 DNA模板 合成引物 四种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 解旋酶 温控设备 变式训练 A B C D 解析 选D 在PCR反应中 解旋是通过热变性实现的 用不到DNA解旋酶 其他各项都是反应必需的 对PCR技术中DNA片断的扩增方法和有关计算混淆不清在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析 PCR技术能快速扩增DNA片段 在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝 有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题 据图回答相关问题 1 在相应的横线上写出引物 并在复性这一步骤中将引物 置于合适的位置
10、 2 在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子 3 若将作为原料的四种三磷酸脱氧核苷酸用32P标记 请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是 循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为 解析 1 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA 只能从3 端延伸DNA链 引物就提供了3 端 子链延伸方向为5 3 引物 与b链部分碱基互补 引物 则与a链部分碱基互补 且连接到a链的3 端 故引物 的结构为5 G A OH 复性结果为 HO A G 5 5 G G T C 3 2 经过一次循环后 产生的两个DNA分子分别含有引物 和引物 3 由于作为原料的四种三磷酸脱氧核糖核苷酸被32P标
11、记 所以新合成的子链均含有放射性 一次循环后的两个DNA各有一条链含32P 若复制n次 产生子链共2n 2 其中只有亲本的两条母链不含32P 则其所占比例为2 2n 2 1 2n 答案 1 5 G A OHa链5 G G T C 3 HO A G 5 2 5 G G T C 3 3 C C A G 5 3 C C A G 5 5 G G T C 3 3 每个DNA分子各有一条链含32P标记1 2n 纠错总结 1 DNA母链的3 端对应着子链的5 端 即DNA的两条链是反向平行的 2 DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3 端上 需要模板 而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口 不需要模板 3 理论上DNA扩增的计算 DNA扩增与DNA复制类似 呈指数扩增 若只有一条DNA模板 则复制n次后有2n条DNA 若一开始有a条模板 则复制n次后有a 2n条DNA 实际操作过程中由于无关变量的影响 一般来说实验值要略小于理论值 若扩增效率为x y代表DNA片段总数 n代表循环次数 那么y 1 x n
