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1、序号： 编码： “挑战杯”大学生课外学术科技作品竞赛决赛作品申报书 作品名称： 猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备 所在学院： 动物科学学院 申报者姓名 （集体名称）： 张雨微 类别：自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文科技发明制作A类科技发明制作B类A1申报者情况（个人项目）说明：1必须由申报者本人按要求填写，申报者情况栏内必须填写 个人作品的第一作者（承担申报作品60%以上的工作者）； 2本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。申报者情况姓 名张雨微性别女出生年月1988年5月所在学院动物科学学院专业动物生物技术现学历本科年级三学制四年入学时间2006
2、年9月作品全称猪生长抑素(SS)RNAi效应的假型慢病毒制备毕业论文题目通讯地址华南农业大学华山学生宿舍23栋505邮政编码510640单位电话常住地通讯地址华南农业大学华山学生宿舍23栋505邮政编码510640住宅电话020-87344523合作者情况姓 名性别年龄学历所在单位叶康男21本科华南农业大学朱俊女21本科华南农业大学资 格 认定学院学籍管理部门意见 是否为2009年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的各类高等院校中国学生（含本科生和研究生）。是 否若是，其学号为： （学院盖章） 年 月 日院系负责人或导师意见 本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果。 是 否负
3、责人签名： 年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备作品分类（D）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰
4、写的目的和基本思路SS于1972年首次发现能抑制GH的分泌，目前在生产上采取降低SS水平，解除SS对GH、IGFI等的抑制，达到促进动物生长的目的。随着胚胎技术和转基因技术的发展，在动物整体水平上敲除或沉默目的基因或导入外源基因改良动物的生产性能已得到了广泛的研究与应用。一种比较好的研究思路和策略就是在整体水平上敲除或沉默SS基因或降低表达水平可长久性、可遗传性获得低SS水平的转基因动物。本实验在已有研究的基础上，拟选择在动物生长调控中起重要作用的负调节因子-生长抑素（SS）作为靶基因，制备最优RNAi效应的假型慢病毒，以便从遗传角度有效获得促生长的优良转基因动物，并为研究动物生长调控提供有益
5、的动物模型。作品的科学性、先进性及独特之处（1）在方法上创新性为动物整体水平上缄默SS基因表达提供优良RNAi效应的shRNA序列；（2）在思路上前沿性提出利用慢病毒载体与RNAi技术相结合廉价，为快速生产SS基因部分缄默的转基因动物模型奠定一定的实验基础。作品的实际应用价值和现实意义本实验选择在动物生长调控中起重要作用的负调节因子-生长抑素（SS）作为靶基因，制备最优RNAi效应的假型慢病毒，以便从遗传角度有效获得促生长的优良转基因动物，为畜牧业动物育种改良可提供良好的经济利益和社会效益，也为这项技术早日进入实际应用打下基础，并可为研究动物生长调控提供有益的动物模型。学术论文文摘生长抑素SS
6、是动物生长激素GH释放的负性因子，其在血液中浓度下降（如免疫中和）能间接促进动物生长、提高动物的生产性能。下调SS基因的表达成了改良动物生长性能的方法。我们用基因转染技术在动物体内表达SS-HBsAg融合蛋白产生中和抗体得到促生长效果。RNAi缄默靶基因的表达在多种生物体内获得成功应用。shRNA是模仿体内miRNA的结构而构建的能在细胞内表达的短发夹RNA，引起特异的RNAi效应。慢病毒载体能感染分裂细胞也能感染静止细胞，有很强的感染和整合能力，是目前应用前景广泛的一种基因转移载体。本研究在以往工作基础上，结合RNAi和慢病毒载体技术，设计和筛选产生SS靶基因RNAi效应的shRNA表达序列
7、，以便通过慢病毒载体的介导下整合到动物胚胎细胞染色体上，生产出携带SS-shRNA的转基因动物。通过RNAi效应在动物整体水平上缄默SS的表达，从遗传改造的角度达到提高动物生长性能的目的。为提高畜牧业动物生产性能打下理论和实践的基础，同时为动物生长调节的研究建立良好动物模型。作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励2008年中国畜牧兽医学会动物生理生化学分会（西安.杨凌）畜牧与兽医增刊：慢病毒载体介导的RNA干扰生长抑素表达下调及转基因动物模型的建立鉴定结果无请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录1、 SS基因RNAi干涉效果的筛选2
8、、 慢病毒载体的制备申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）动物的生产性能是畜牧业发展过程中的重要经济性状，生长抑素(SSI)是抑制动物生长的主要因素。SST主动免疫和添加SST抑制剂虽然取得了一定的效果但是仍不理想，而传统的育种方法在改善动物的生长性能方面进程非常缓慢，因而探索探索新的方法和技术十分必要。RNAi是下调靶基因的有效方法，慢病毒载体也是目前应用前景最广泛的基因转移载体，本试验根据靶基因SST设计和筛选出了最优RNAi效应的靶基因-shRNA序列，并已成功构建到慢病毒载体上，通过慢病毒载体和精原干细胞介导联合制备出稳定表达靶基因-shRNA的可遗传的转基因动物，利用RNA
9、i效应在动物整体水平上下调SST的表达，从而到达提高动物生产性能的目的。科研管理部门签章 年 月 日C.当前国内外同类课题研究水平概述说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。（1）生长抑素对生长激素分泌的负调控生长激素（growth hormone,GH）是调节动物和人生长的主要激素，由垂体分泌，主要受下丘脑分泌的正性调控因子即生长激素释放因子（growth hormone releasing factor,GRF）或称生长激素释放激素（growth hormone releasing hormone,GHRH）和负性调控因子即生长激素释放抑制激素（somatost
10、atin,SS）或简称生长抑素的双向调节。研究表明SS能抑制脑垂体细胞的cAMP生成，提高cGMP浓度，抑制GH的合成与释放，降低血液GH浓度。同时SS还能调节GRF的释放，影响GRF基因的表达，通过拮抗GRF的作用以协同控制GH的水平。（2）生长抑素在动物促生长领域的应用GH的水平影响骨、软骨的生长以及肌蛋白的合成与沉积等，从而影响动物和人的生长状况。在生产应用上GH具有促生长，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高饲料转化率等方面的作用，有着广泛的经济价值和社会效益。生长抑素（SS）通过抑制垂体分泌GH，从而降低GH水平。目前在生产上采取降低SS水平，解除SS对GH、IGFI等的抑制，达到促进动
11、物生长的目的，如主动免疫技术。随着胚胎技术和转基因技术的发展，在动物整体水平上敲除或沉默目的基因或导入外源基因改良动物的生产性能已得到了广泛的研究与应用。一种比较好的研究思路和策略就是在整体水平上敲除或沉默SS基因或降低表达水平可长久性、可遗传性获得低SS水平的转基因动物。（3）RNAi技术制备转基因动物RNAi（RNA interference）称为RNA干涉，通过双链RNA（dsRNA）诱导与之同源的mRNA降解，导致目标基因转录后缄默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）的现象或机制。在动物机体中，有两种小分子RNA能介导这种现象的发生，mi
12、croRNA(miRNA)和siRNA。前者形成分子内双链RNA，后者形成分子间双链RNA，两者双链RNA在细胞质内经Dicer酶切割成长度约为2125个nt片段，即小分子双链RNA。在解旋酶(helicase)的作用下解开双链RNA，其中仅保留一条RNA链与RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)结合，根据碱基互补配对原则识别靶mRNA，引起靶mRNA被剪切降解或翻译的抑制。2002年，Hasuwa等人成功地建立了第一例应用RNAi的转基因小鼠。几乎同时多数研究者们利用RNA聚合酶III的启动子构建shRNA的载体应用于转染哺乳动物的细
13、胞系，结果对靶基因均产生了稳定的转录后缄默效果，表达下降90%以上。2006年Dann等人通过慢病毒介导RNAi敲除了大鼠上的Dazal基因，构建了两条shRNA序列（pLLU2G-Dazl1和pLLU2G-Dazl2），结果这两条转基因序列对靶基因Dazal的表达均产生了几乎完全的抑制，并在后代中获得了稳定的可遗传的Dazl-shRNA转基因大鼠。shRNA转基因小鼠或大鼠的出现使得RNAi技术在哺乳动物整体水平上进行靶基因的敲低或缄默成为可能。研究表明与建立在胚胎干细胞和同源重组技术上的基因敲除相比，用RNAi技术建立转基因动物无论是时间上还是在效率上都有着很大的优势。（4）慢病毒载体的特
14、点与构建慢病毒（lentivirus）是一种逆转录病毒，引起慢性感染得名。与其他逆转录病毒相比不仅感染分裂细胞、也感染非分裂细胞，即静止细胞如神经细胞、巨嗜细胞、造血干细胞和肌肉细胞等，大大提高了感染效率，感染之后能高效整合和表达目的基因。用慢病毒载体感染动物卵母细胞和胚胎细胞能有效构建转基因动物。Hofmann等用含GFP目的基因的慢病毒载体转染猪胚胎，产下46只小猪中，有32只携带GFP基因，其中30只能表达GFP。同时用该载体转染牛的卵母细胞时也获得了GFP高表达率。慢病毒载体（lentiviral vector,LV）的构建原理是将HIV-1基因组中的顺式作用元件（如包装信号和长末端重复序列）和编码反式作用蛋白的序列分离。载体系统分成包装部分和载体部分，其中包装部分由去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列构成，仅提供病毒包装所需蛋白；载体部分与包装部分互补，含包装、逆转录和整合所需顺式作用序列。（5）慢病毒载体
