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1、高效液相色谱 HPLC 主讲 郝凤霞能源化工重点实验室 目录 基础理论上机操作前的准备工作Agillent1100的操作常见故障排除HPLC在科研中的应用 溶于流动相 mobilephase 中的各组分经过固定相时 由于与固定相 stationaryphase 发生作用 吸附 分配 离子吸引 排阻 亲和 的大小 强弱不同 在固定相中滞留时间不同 从而先后从固定相中流出 1 色谱柱的分离原理 色谱分析法的分类 按两相的状态分类 2 分离模式 键合相色谱 液液色谱 尺寸排阻色谱 键合相色谱正相色谱 流动相极性固定相极性常规分析 80 色谱图和峰参数色谱图 chromatogram 样品流经色谱柱和
2、检测器 所得到的信号 时间曲线 又称色谱流出曲线 基线 baseline 经流动相冲洗 柱与流动相达到平衡后 检测器测出一段时间的流出曲线 一般应平行于时间轴 噪音 noise 基线信号的波动 通常因电源接触不良或瞬时过载 检测器不稳定 流动相含有气泡或色谱柱被污染所致 漂移 drift 基线随时间的缓缓变化 主要由于操作条件如电压 温度 流动相及流量的不稳定所引起 柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移 3 HPLC中的基本概念和术语 色谱峰 peak 组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分 正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线 高斯Gauss曲线 峰高 peakheig
3、ht h 峰的最高点至峰底的距离 峰宽 peakwidth W 峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离 半峰宽 peakwidthathalf height Wh 2 峰高一半处的峰宽 峰面积 peakarea A 峰与峰底所包围的面积 死时间 deadtime t0 不保留组分的保留时间 即流动相 溶剂 通过色谱柱的时间 保留时间 retentiontime tR 从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间 流动相的洗脱方式 等度洗脱 梯度洗脱 分析时间长 分离度差 MeOH H2O 4 6 MeOH H2O 8 2 等度洗脱 95 30 MeOH浓度 梯度洗脱 梯度洗脱是HP
4、LC的常用手段 梯度洗脱装置流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂 在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成 以调节它的极性 使样品中每个组分都有较高的分离度 从而实现各组分的圆满分离 梯度洗脱可提高柱效 缩短分析时间 改善检测器的灵敏度 它类似于气相色谱的程序升温技术 4 高效液相色谱法的应用范围 高效液相色谱法适于分析沸点高 相对分子质量大 受热易分解的不稳定有机化合物 生物活性物质以及多种天然产物 这些化合物约占全部有机化合物的80 可应用于化工生产 制药工业 食品工业 生物化工 医学临床检验和环境监测等领域 5 HPLC的系统 输液泵相当于人的心脏 不断提供连续 稳定 精确的流量进样
5、器样品引入系统色谱柱关键部分 在这里样品实现分离检测器对分离后的样品进行检测数据记录与处理装置 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 HPLC的系统组成 Agilent1100高效液相色谱仪 储液瓶 真空脱气机 混合室 自动进样器 分离柱 VWD 手动进样 自动进样 六通阀进样演示 分离系统 色谱柱 功能 组分分离 目标 分辨力强效率高 吸附剂 化学键和固定相色谱柱化学键合相色谱柱 70 将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上 而形成化学键和固定相 进而形成化学键和相色谱柱 反相 C18 65 C8 15 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法 正相 20
6、 NH2 CN其它 手性柱 离子交换柱 10 柱温箱 控制温度 保证分析结果重现性升高温度 降低了流动相的黏度 降低柱压 保证色谱系统的稳定性 升温对于反相HPLC分离强疏水肽的影响 B27 流动相 A 含0 05 三氟乙酸的水B 含0 05 三氟乙酸的乙腈2 B min进样量 100 L 50 g的6M脲 5 乙酸 UV 210nm流速 1mL min室温 液相色谱柱 C18色谱柱尺寸 4 6x250mm5 m 室温300C400C500C600C700C 提高柱温 可增加柱效 提高灵敏度 检测系统 药典中的液相检测器 检测器简介 一 紫外吸收检测器 UVD 原理 用特定波长的紫外光照射样品
7、池 通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器 它具有波长固定 波长可变和光二极管阵列三种类型 特点 选择性检测器 波长检测范围 190 800nm 对流量和温度敏感性低 灵敏度较高 10 9g 应用最广 对大部分有机化合物有响应 对流动相的流速和温度变化不敏感 波长可选 易于操作 可用于梯度洗脱 定量基础 Lambert Beer定律 A Kbc 2020 6 13 光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展 光电二极管阵列检测器 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 如图所示 检测器简介 二 荧光检测器 fluorescencedetector FLD 原理
8、某些溶质在紫外光激发后能发射可见光 荧光 的性质检测 特点 选择性检测器 灵敏度高 10 12g 对流量和温度敏感性低 对多环芳烃 维生素B 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药 药物 氨基酸 甾类化合物等有响应 检测器简介 三 检测器简介 四 蒸发光散射检测器 ELSD 原理 通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器 色谱柱后流出物在通向检测器途中 被高速载气 氮气 喷成雾状液滴 再进入蒸发漂移管中 流动相不断蒸发 含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒 被载气载带通过检测器 在检测器中 光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量 特点 消除了溶剂的干扰 不受温度变化影响 灵敏度高 是通用型检测器 检测
9、器简介 五 电导检测器 ECD 原理 监测溶液的电导率变化的检测器 特点 选择性检测器 测量时要求恒温 对流动相的组成变化有明显响应 灵敏度低 10 3g 适用于离子型化合物 示差折光指数检测器 RID 原理 监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器 特点 通用性检测器 温变化要保持在 0 001 灵敏度低 10 6g 二 上机操作前 我们需要准备好什么 如 样品怎么处理 流动相怎么选 仪器参数怎么设置 1 样品的前处理 最好使用流动相溶解样品 使用预处理除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质 使用0 45 m的过滤膜过滤除去微粒杂质 样品准备 样品过滤头的类型 3
10、0mm内径 适用于大进样量的过滤 由0 2 m和0 45 m两种规格材料有 纤维素 醋酸纤维 聚四氟乙烯 处理样品体积少于50 l 13mm内径 适用于范围广的过滤 由0 2 m和0 45 m两种规格 3mm内径 适用于小进样量的过滤 由0 2 m和0 45 m两种规格 处理样品体积为7 l 滤膜类型 聚四氟乙烯滤膜 适用于所有溶剂 酸和盐 并无任何可溶物 醋酸纤维滤膜 不适用于有机溶剂 特别适用于水基溶液 推荐用于蛋白质和其相关样品 尼龙66滤膜 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液 可用于强酸 70 乙醇 二氯甲烷 不适用于二甲基甲酰胺 再生纤维素滤膜 具有蛋白吸收低 同样适用水溶性样品和有机溶
11、剂 注意 1 每张滤膜只能用一次 2 水相和有机相不要搞混 2 流动相的配制 流动相对样品具有一定的溶解能力 保证样品组分不会沉淀在柱中 或长时间保留在柱中 流动相具有一定惰性 与样品不产生化学反应流动相的黏度要尽量小分离效果好柱压低 延长液体泵的使用寿命 可运用提高温度的方法降低流动相的黏度 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应 如使用UV检测器 最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制 流动相沸点不要太低 否则容易产生气泡 导致实验无法进行 在流动相配制好后 一定要进行脱气 准备流动相 1 色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇水 超纯水 18 2M cm 过滤装置 为什么要过滤 1 对色谱柱 仪器起到保护
12、作用色谱柱 由于填料颗粒很细 色谱柱内腔很小 溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞 仪器 溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损 同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损 2 消除由于污染对分析结果的影响 3 溶剂准备 脱气 目的 流动相使用前必须进行脱气处理 以除去其中溶解气体 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时 因压力降低而产生气泡 气泡会增加基线的噪音 造成灵敏度下降 甚至无法分析 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化 柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能 若用FLD 可能会造成荧光猝灭 常用的脱气方法 氦气脱气法 利用液体中氦气的溶解度比空气低 连
13、续吹氦脱气 效果较好 但成本高 加热回流法 效果较好 但操作复杂 且有毒性挥发污染 抽真空脱气法 易抽走有机相 超声脱气法 流动相放在超声波容器中 用超声波振荡10 15min 此法效果最差 在线真空脱气法 Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术 在线脱气 智能控制 无需额外操作 成本低 脱气效果明显优于以上几种方法 并适用于多元溶剂体系 3 流动相流速的选择 具体根据色谱柱的内径选择 4 波长选择 首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱 以选择合适的测量波长 如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰 从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值 如吸收度小于0 5时 HPLC
14、测定的面积将会很小 5 记录时间 第一次测定时 应先将空白溶剂 对照品溶液及供试品溶液各进一针 并尽量收集较长时间的图谱 如30分钟以上 以便确定样品中被分析组分峰的位置 分离度及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来 确定是否会影响主峰的测定 三 Agilent1100机器操作 1 检查流动相 Purge阀 清洗阀 排液阀 处于松开状态 Purge阀 逆时针打开清洗阀 顺时针关闭清洗阀 毛细管出口 流向进样器 废液管 清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶 1 检查流动相 Purge阀 清洗阀 排液阀 处于松开状态把流动相放入溶剂瓶中 且滤头浸入到液面下A水B甲醇C乙腈D缓冲液 2 冲洗管路 选择流动
15、相为10 异丙醇 90 水 按此比例配好溶液后存放在矿泉水瓶中 调节流速大约为1d 3s 3 打开电脑 等待TAP窗口出现 4 打开1100各模块开关 指示灯状态 5 待1100自检完毕 双击online 启动工作站化学工作站自动与1100LC通讯 进入工作站画面 其它功能菜单 文件处理 运行控制 仪器控制 序列 放弃任务 在线帮助 工作站任务切换快捷键 方法存取快捷键 序列存取快捷键 运行方法 运行序列 面对工作站 我该怎么办 WhatshouldIdo 我们知道要运行样品需要设置控制仪器的参数 比如泵流速 流动相比例 柱温 检测器波长 样品校正等 在Agilent化学工作站中我们把仪器控制
16、和数据分析以及仪器相关的运行等所有参数称为一个方法 Method 所以要运行一个样品 首先要得到一个正确的方法 在Agilent化学工作站中要得到方法要么调用一个已经存在的方法 要么自己编辑一个新的方法 一般来说 通过查阅资料比如国家标准或行业标准 药典 专业技术资料 EPA等都可以得到样品分析的详细方法 您需要做的就是把这些方法在Agilent化学工作站中建立起来 然后运行仪器并得到数据 6 方法的编辑 1 调用方法 在Method中点击LoadMethod 工作站弹出下面对话框 在右面对话框中选中要调用的方法名 点击 OK 该方法即被激活 使用EditEntireMethod编辑一个完整的方法 2 编辑一个新方法 选择所要编辑的内容 画面1 方法组成 在你想要的部分前选中 否则方法里将不包括该部分的内容 比如本方法不包括数据分析的内容 方法信息 仪器控制与数据采集 数据分析 运行时间表 方法信息 MethodInformation 画面2 方法信息 输入您想要对方法的说明 比如方法的用途 来源等信息 包括 流量 Flow 流动相组成 Solvents 停止采集时间 StopTime
