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1、饲料中苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇的测定 高效液相色谱法编 制 说 明国家饲料质量监督检验中心（成都）成都市产品质量监督检验院二一八年二月2目 录一、任务来源1二、标准制订的意义及特点1三、标准编制原则和依据2四、标准主要内容确定依据及主要技术路线21、标准主要内容确定依据22、主要技术路线2五、分析条件的选择与优化31、样品前处理条件优化32、仪器分析条件优化72.1流动相组成与梯度72.2色谱柱选择试验.82.3色谱柱柱温、流动相流速、进样体积.112.4检测波长.112.5最终确定的仪器条件.12六、方法性能评价.141、线性范围142、精密度153、回收率164、检出限及定量限175、实际
2、样品检测情况18七、方法实验室验证情况18八、其他情况说明2122一、任务来源 本标准根据国标委关于下达2010年国家标准制修订计划的通知（国标委综合201087号）立项，项目编号为：20100301-T-469。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准由国家饲料质量监督检验中心（成都）、成都市产品质量监督检验院起草。 二、标准制订的意义及特点 苯甲酸雌二醇（Estradiol benzoate）和戊酸雌二醇（Estradiol valerate），属于固醇类激素，呈脂溶性，靶组织众多，包括生殖系统、骨骼、心血管等。自20世纪50年代起激素被广泛用作动物生长促进剂，它可以促进家畜的
3、生产力，降低动物死亡率，缩短动物饲养周期，促进动物性产品产量的增长，具有稳定的增产效果。近年来，国内外由饲料安全问题引发的食品安全及环境污染事件频频发生。无论是临床研究还是动物实验都证明了雌激素受体在恶性肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色。根据实验室研究和流行病学的调查结果，激素类物质可以通过食物链（动物体内残留）和环境残留（饮用水及排泄物）对人和动物健康、社会和生态环境造成直接和潜在危害。我国农业部2002年发布的176号公告，明确规定了禁止在饲料和动物饮用水中使用苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇。农业部第193号公告明确规定了禁止在所有食用动物饲养中使用苯甲酸雌二醇以促生产或其它用途。由于目前还没
4、有饲料中苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇含量的国家标准检测方法，为了保障人类动物源性食品的安全，从饲料源头有效监控激素类物质的摄入，因此建立简便、快速、准确、灵敏的方法用于饲料中苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇的检测迫在眉睫。目前, 国内外大多文献报道的激素残留检测主要针对动物源食品，关于饲料方面的报道还较少。在饲料雌激素检测方面，对己烯雌酚、17-雌二醇、雌酮、雌三醇的检测报道较多，对苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的报道甚少。检测方法主要是高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法以及酶联免疫吸附法。气相色谱法前处理简单较为繁琐，需要对样品进行衍生化处理, 耗时长；免疫分析法易出现
5、假阳性结果，仅能测定少数几种激素；高效液相色谱法前处理简单，方法灵敏重现性好，准确度高。为了进一步规范我国饲料市场，保证我国饲料质量安全、维护广大消费者的利益，以及为监督管理机构的执法提供科学依据和技术支撑，特制订了饲料中苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇含量的测定 高效液相色谱法。本标准方法准确、快速、简便，检出限、重现性、再现性和回收率均符合检测要求。 苯甲酸雌二醇 戊酸雌二醇三、标准编制原则和依据本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则和GB/T 20001
6、.4-2015标准编写规则 第4部分：试验方法标准的要求进行编写。四、标准主要内容确定依据及主要技术路线1、标准主要内容确定依据实验收集了国、内外相关资料，先后查询了美国、日本等国家及欧盟相关标准方法，确定了高效液相色谱法测定饲料中苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇含量的技术路线及主要技术指标（检出限、定量限、精密度、回收率等），并采集市售预混合饲料、配合饲料、浓缩饲料等大量实验样品，获得了大量的第一手数据，通过数据分析整理，为本方法的确定建立打下了坚实的基础。2、主要技术路线均匀饲料样品提取方法选择与优化液相色谱分析条件优化建立测定方法方法性能评价实际样品测定测定结果分析实验室间方法验证可行 五、分析
7、条件的选择与优化1、样品前处理条件优化1.1 样品提取方法试验实验对比了QuEChERS、固相萃取法、直接提取进样三种方法对待测物质的提取效率和净化效果。图1是加标饲料样品在三种提取方式下的色谱图。结果显示：采用第二种方法，苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇的提取效率都在85 %以上，且杂质少。因此，实验采用固相萃取法提取样品。图1 三种提取方式下加标饲料样品色谱图（A：直接提取；B：固相萃取法；C：快速萃取法（QuEChERS）1.2 提取溶剂、体积和时间选择试验实验比较了甲醇、乙腈、甲醇+水（85+15）、乙腈+水（85+15）作为提取溶剂的提取情况。图2是不同提取剂对同一样品的提取效率比较图。实验
8、比较了提取剂体积分别为10.0 mL、15.0 mL 、20.0 mL、25.0 mL、30.0 mL、40.0 mL时，提取效率的变化，结果见图3。实验比较了提取时间分别为10.0 min、15.0 min、20.0 min、25.0 min、30.0 min、40.0 min、50.0 min、60.0 min时被测物质的提取效率，结果见图4。由图可知：用25.0 mL甲醇+水（85+15）作为提取溶剂，当提取时间为30.0 min时，两种被测物的提取效率最好。图2 提取剂对提取效率的影响图3 提取剂体积对提取效率的影响图4 提取时间对提取效率的影响1.3 样品提取液稀释比例试验 被测物质
9、在萃取柱上的保留能力与过柱时样品溶剂的极性有关。移取相同体积的样品溶液，分别按照0.0、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0的倍数用水稀释，考察样品溶剂极性对被测物质在萃取柱上保留的影响，结果见图5。当稀释倍数为3时，两种被测物质的回收率最好。图5 样品提取液稀释倍数对被测物质回收率的影响1.4 固相萃取柱的选择试验实验对比了Cleanert PEP（500 mg/6 mL），Cleanert ODS C18（500 mg/3 mL），Welchrom C18E（500 mg/3 mL），Heaion C18（500 mg/3 mL）四种SPE小柱对饲料样品被测物质的浓缩和净化作用，
10、结果见图6。由图可知：Cleanert ODS C18、Heaion C18回收率更高，应优先选择该两种SPE小柱。实验选用Heaion C18柱。图6 不同SPE小柱对提取效率的影响1.5 洗脱溶剂选择和用量试验在洗脱过程中，分段收集洗脱液1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL、1.0 mL，并在氮气流下吹干，用1.0 mL甲醇溶解后测定，各色谱图见图7，洗脱效率计算结果见表1。图7 预混合饲料分段洗脱液的色谱图表1 洗脱剂用量对洗脱效率的影响 洗脱效率/%目标物 洗脱用量/mL1.01.01.01.01.0苯甲酸雌二醇0.00059.84035.5450.0310.000戊
11、酸雌二醇0.00061.54123.8500.0450.0001.6 小结通过对样品前处理各条件的优化试验，最终确定的样品前处理条件如下：称取5 g饲料样品于250 mL玻璃具塞三角瓶中，准确加入25 .0mL甲醇+水（85+15），在往复式摇床上以140 r/min的速度振荡提取30 min，再以5000 r/min的速度离心5 min，取上清液2 .0mL于10 mL比色管中，并加入6 .0mL超纯水稀释，混合，摇匀。用6 .0mL甲醇、6 .0mL纯水活化C18（500 mg/3 mL）小柱，待纯水流出小柱平衡完毕，将稀释的样品提取液转入小柱内，保持流速约为1 mL/min，用6 .0m
12、L纯水分三次清洗比色管，再用3.0 mL纯水淋洗小柱。待淋洗液流尽，减压抽干，用4 .0mL甲醇洗脱，在401 下用N2吹干，用1 .0mL甲醇溶解残留物，溶液过0.22 m滤膜后，待分析。2、仪器分析条件优化2.1 流动相组成与梯度 实验比较了采用乙腈和水、甲醇和水、乙腈和乙酸铵（0.02 mol/L）、甲醇和乙酸铵（0.02 mol/L）分别作为流动相，被测物质之间和被测物质与杂质之间的分离度。实验发现采用乙腈和水为流动相进行梯度洗脱可以使被测物质与杂质达到很好的分离效果。由于两种目标化合物的理化性质差异，其在色谱柱上的保留时间不同，适当运用梯度洗脱有利于节省分析时间，并能达到各组分完全分
13、离的目标。采用表2的梯度洗脱程序对两种目标化合物进行分析。图8为乙腈初始梯度为42 %、44 %、46 %、45 %时浓缩饲料的色谱图。乙腈流动相初始梯度为45 %时，峰形对称，且与杂质分离效果较好。图8 乙腈初始梯度为42%（A）、44%（B）、46%（C）、45%（D）的浓缩饲料色谱图（a：苯甲酸雌二醇 b：戊酸雌二醇）2.2 色谱柱选择试验 实验对比了Dionex C8（250 mm4.6 mm, 5 m） 、DionexC18（250 mm4.6 mm, 5 m）、Welch ltimate XB-C18（250 mm4.6 mm, 5 m）三种色谱柱对样品的实际分离效果。结果显示：D
14、ionex C18 和WelchC18对四种饲料样品的分离效果都比较好，各标准物质之间的分离度都大于1.5，满足物质分离要求。预混合饲料在两种色谱柱上分离效果都比较好，浓缩饲料和配合饲料由于杂质含量多，在C8色谱柱上苯甲酸雌二醇与杂质的分离效果较差。实验选用DionexC18作为色谱分离柱。图9为同一条件下浓缩饲料在C8、C18上的色谱图。图10、11、12分别为预混合、配合、浓缩饲料的空白和加标图谱。图13为混合标准溶液色谱图。图9 浓缩饲料在DionexC18和C8色谱柱上的色谱图（A: C18 B：C8）图10 预混合饲料空白（A）、加标（B）的色谱图图11配合饲料空白（A）、加标（B）的色谱图 图12浓缩饲料空白（A）、加标（B）的色谱图图13 标准溶液的色谱图(纯甲醇)2.3 色谱柱柱温、流动相流速、进样体积实验比较了20.0 、25.0 、30.0 、35.0 、40.0 、45.0 六个温度下，被测物质的保留时间、峰面积、峰高和与杂质的分离效果。实验选择30.0 为实验分析的色谱柱柱温。实验比较了0.8 mL/min 、1.0 mL/min、1.2 mL/min、1.5 mL/min的流动相流速。实验选用1.0 mL/min为流动相流速。
