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1、ICS65.120B 46中华人民共和国国家标准GB/T XXXXXXXXX饲料中肠杆菌科检验Determination of Enterobacteriaceae in feed送审稿XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施GB/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。本标准起草单位：江苏海企长城股份有限公司、淮安出入境检验检疫局、江苏出入境检验检疫局、淮阴师范学院。本标准主要起草人：王远见、冯民、宦海霞、刘尧、蒋原、任盈盈、柯家法、张扬、张科、颜智勇、张敬友。1
2、4饲料中肠杆菌科检验1 范围本标准规定了饲料中肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的定量检验方法。本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的饲料中肠杆菌科的计数；第二法适用于肠杆菌科含量较低的饲料中肠杆菌科的计数。2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1肠杆菌科 Enterobacteriaceae在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2肠杆菌科计数 Enumeration of Enterobacteriaceae按本标准规定方法，对每克或每毫升样品中的肠杆菌科进行计数。2.3最可能数 most probable number; MPN
3、基于泊松分布的一种间接计数方法。3 试剂或材料3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A.1。3.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤（EE肉汤）：见附录A.2。3.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）：见附录A.3。3.4 营养琼脂（NA）：见附录A.4。3.5 葡萄糖琼脂：见附录A.5。3.6 革兰氏染色液：见附录A.6。3.7 氧化酶试剂：见附录A.7。4 仪器设备4.1 恒温培养箱：36 1 。4.2 水浴箱：46 1 。4.3 均质器（312次挤压/秒）。4.4 振荡器。4.5 电子天平：感量0.1 g。4.6 显微镜：10倍100倍。4.7 无菌培养皿：直径90 mm。4.8 无菌吸管
4、：1 mL（0.01 mL刻度）、10 mL（0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。4.9 试管：18 mm180 mm、15 mm150 mm。4.10 无菌锥形瓶或等效容器：150 ml、500 mL。4.11 均质袋。4.12 pH计或pH比色管或精密pH试纸。5 平板计数法检验程序（第一法）肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。计算肠杆菌科菌落数报告检样25g（mL）样品+225 mL BPW，均质10倍稀释系列选择23个适宜连续稀释度的样品匀液，各取1 mL分别加入无菌培养管内每皿中倾注10 mL15 mL VRBGA培养基，混匀计数，挑取典型菌落，接种于NA平板葡萄糖发酵试验氧化酶试验
5、革兰氏染色试验36 1 24 h2 h36 1 18 h24 h图1 肠杆菌科平板计数法检验程序5.1 平板计数法试验方法5.1.1 样品的处理和制备5.1.1.1 易粉碎固体样品：25 g待测样品加入到盛有225mL BPW的无菌均质杯中，800010000 r/min均质1 min2 min，或放入盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍打式均质器中拍打1 min2 min，制成1:10的样品匀液。5.1.1.2 不易粉碎固体样品：取25g以上的单个或多个样品，装于均质袋中，按照1：9比例加入适量BPW，用拍打式均质器中拍打1 min2 min，制成1：10的样品匀液。5.1.1.3
6、液体样品（包括原液）：以无菌吸管吸取25 mL样品放入盛有225 mL BPW 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成110的样品匀液。5.1.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入盛有9 mL BPW的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。5.1.1.5 按照7.1.4的操作方法，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。5.1.2
7、 接种和培养5.1.2.1 根据样品的污染情况及不同种类饲料中肠杆菌科的限量要求，选择2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液加入到无菌培养皿中，每个稀释度接种2个无菌培养皿。同时，分别吸取1 mL BPW加入两个无菌培养皿中做空白对照。5.1.2.2 将10 mL15 mL冷却至46 的VRBGA（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，使样品匀液与培养基充分混匀。5.1.2.3 待琼脂凝固后，再向其中倾注约5 mL一薄层的VRBGA培养基覆盖平板表层，以防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。5.1.2.4 待培养皿中的培养基凝固后，翻转培养皿，置于36 1 培养18 h2
8、4 h。5.1.3 菌落计数和确认5.1.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15 CFU150 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。5.1.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。5.1.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。5.1.3.4 从每个平板
9、上至少挑取5个（小于5个全选）典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。5.1.3.5 典型菌落的确认:a) 分别将所挑选的每一个菌落，划线于营养琼脂平板，36 1 培养18 h24 h，挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。b) 革兰氏染色镜检：肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌，无芽胞，大小为（0.31.0）m（1.06.0）m。c) 氧化酶试验：用铂/铱接种环或玻璃棒（不要用镍铬接种环）挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂的滤纸上，试纸的颜色在10 s内变为蓝紫色，判为阳性反应。d) 葡萄糖发酵试验：用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌
10、落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于36 1 培养24 h2 h，若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应。5.1.4 结果的计算5.1.4.1 一般原则若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内，按式（1）计算，示例见B.1、B.2。（1）式中：N 样品中肠杆菌科菌落数；确证的肠杆菌科菌落数之和；n1 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）；n2 第二稀释度（高稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落）；d 稀释因子（第一稀释度）。其中，按式（2）计算。（2）式中：确证的肠杆菌科菌落数；b 某一平板中A个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数，bA；A 某一平板中用于确认试验的菌落数；
11、C 某一平板中典型菌落总数。5.1.4.2 低菌落数若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15 CFU，具有确证的肠杆菌科菌落，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，或典型菌落数均小于15 CFU，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。5.1.4.3 特殊情况第一稀释度平板上的典型菌落数均大于150 CFU，且有确证的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15 CFU150 CFU之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，示例见B.5。若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计
12、数范围内，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。5.1.5 结果的报告5.1.5.1 菌落数小于100 CFU/g(mL)时，以整数报告。5.1.5.2 菌落数大于或等于100 CFU/g(mL)时，对第3位数字进行修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，采用两位有效数字。5.1.5.3 数字修约按“四舍五入”原则进行。5.1.5.4 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。5.1.5.5 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。6 MPN计数法检验程序（第二法）肠杆菌科MPN计数法检验程序见图2。检样25 g（mL）样品+225 m
13、L BPW，均质10倍稀释系列选择3个适宜连续稀释度的样品匀液，每个稀释度3管，共9管BPW36 1 18 h2 h1 mL BPW培养物+10 mL EE肉汤36 1 24 h2 h接种VRBGA平板36 124 h2 h可疑菌落移种NA平板18 h24 h36 1 革兰氏染色试验氧化酶试验葡萄糖发酵试验查MPN表报告图2 肠杆菌科MPN计数法检验程序6.1 MPN法试验方法6.1.1 样品的处理和制备按7.1进行。6.1.2 接种和培养6.1.2.1 非选择性前增菌根据预估样品的污染情况及相关限量要求，选择适宜的3个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度3管，共9管BPW于36 1 培养18 h
14、 2 h。6.1.2.2 选择性增菌从BPW各稀释度培养管中，分别移取1 mL培养物，接种于10 mL EE肉汤中，36 1 培养24 h2 h。6.1.2.3 分离用接种环从EE各肉汤管分别取培养物1环，划线接种于VRBGA平板，36 1 培养24 h2 h，观察平板上有无典型菌落。6.1.3 典型菌落确认典型菌落确认见7.3。6.2 结果的报告只要有1个菌落确认为肠杆菌科，其所代表的EE管即为肠杆菌科阳性，依据EE阳性管数查MPN表（见附录C），报告每克（毫升）样品中肠杆菌科的MPN值。称重取样以MPN/g为单位报告，体积取样以MPN/mL为单位报告。附 录 A(规范性附录)培养基和试剂A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)A.1.1 成分蛋白胨10.0 g氯化钠5.0 g磷酸氢二钠3.5 g磷酸二氢钾1.5 g蒸馏水1000.0 mLA.
