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1、 第一节测定生长繁殖的方法 第二节微生物的生长规律 第三节影响微生物生长的主要因素 第四节微生物培养法概论 第五节有害微生物的控制 第六章微生物的生长及其控制MicrobialGrowthandControl 第一节测定生长繁殖的方法 一 测生长量 二 计繁殖数 1 直接法 用血球计数板在显微镜下进行计数 二 计繁殖数 2 间接法 用平板菌落进行的活菌计数 菌数 mL cfuX稀释度X10 第二节微生物的生长规律 一 微生物的个体生长和同步生长 三 微生物的连续培养方法 二 微生物的典型生长曲线 一 微生物的个体生长和同步生长 同步生长通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生
2、长状态 获得同步生长的方法环境条件诱导法机械筛选法 二 微生物的典型生长曲线 growthcurve 生长曲线 当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后 在适宜的温度 通气等体积下 该群体就会由小到大 发生有规律的增长 如果以细胞数目的对数值作纵坐标 以培养时间作横坐标就可画出一条曲线 微生物的典型生长曲线 二 微生物的典型生长曲线 growthcurve 延滞期 lagphase 对外界不良条件例如NaCl溶液浓度 温度和抗生素等化学药物的反应敏感 指少量微生物接种到新鲜培养液中后 在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期 生长速率常数R等于零 细胞形态变大或增长 细胞内RNA
3、尤其是rRNA含量增高 原生质呈嗜碱性 合成代谢活跃 核糖体 酶类和ATP的合成加快 易产生诱导酶 影响延滞期长短的因素 1 接种龄 2 接种量 3 培养基成分 延滞期 lagphase 出现延滞期的原因 指数期 exponentialphase 是指在生长曲线中 紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期 生长速率常数R最大 代时G最短 整个群体的生理特性较一致 酶系活跃 代谢旺盛 细胞各成分平衡增长 生长速率恒定 三个重要参数 1 繁殖代数 n 2 生长速率常数 R 3 代时 G 指数期 exponentialphase G t2 t1 n t2 t1 3 322 lgX2 lgX1 R
4、 1 G 3 322 lgX2 lgX1 t2 t1 X2 X1 2n两边取对数 lgX2 lgX1 nlg2 lg2 0 301 n 3 322 lgX2 lgX1 指数期 exponentialphase 影响代时长短的因素 1 菌种 2 营养成分 3 营养物浓度 4 培养温度 营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响 指数期 exponentialphase 稳定期 stationaryphase 生长速率常数R 0 即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等 菌体产量达到最高点 且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系 用生长产量常数Y表示 Y X X0 C0 C X X0 C0 X 稳定期的细
5、胞干重 g ml培养液 X0 刚接种时的细胞干重C0 限制性营养物的最初浓度 g ml C 稳定时期限制性营养物的浓度 通过对稳定期到来原因的研究 促进了连续培养原理的提出和工艺 技术的创建 对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物 SCP 乳酸 等为目的的一些发酵生产来说 稳定期是产物的最佳收获期 是对维生素 碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期 稳定期的实践意义 IV衰亡期 deathphase 微生物个体死亡速度超过新生速度 整个群体呈现负生长状态 细胞形态发生变化 出现畸形 有的发生自溶 有的合成或释放次生代谢产物 芽孢此期释放 三 微生物的连续培养方法 稳定期到来的主要原
6、因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 有害代谢产物的累计 理化条件的不适宜等 是一种根据培养器内微生物的生长密度 并借光电控制系统来控制培养液流速 使细菌培养液保持恒定的连续培养方法 主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物 1 恒浊器 turbidostat 2 恒化器 chemostat 是一种设法使培养液的流速保持不变 并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行繁殖的连续培养装置 主要获得不同生长速率的菌体 恒浊与恒化培养控制装置 Turbidostat chemostat的比较 分批培养与连续培养的比较 连续培养的优缺点 优点高效自控产品质量稳定节约动力 人力 水和蒸汽等缺点菌种
7、容易退化容易污染杂菌营养物的利用率低于单批培养 微生物的高密度培养 指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术 目前由于研究的微生物种类主要局限于E coliandS cerevisiae等兼性厌氧菌 第三节影响微生物生长的主要因素 一 温度 二 氧气 三 pH值 一 温度 temperature 嗜冷菌 20oC 嗜温菌 20 45oC 嗜热菌 50 60oC 嗜高温菌 80 95oC 极端高温菌 105 150oC 根据温度对微生物的影响分类 ThermophileandBiotechnology 来自嗜热菌的酶可在高温下稳定的催化生物化学反应 其中由The
8、rmusaquaticus中分离出来的DNA聚合酶 Taqpolymerase 已广泛应用于PCR反应 分离自Pyrocuccusfuriosus的pfupolymerase应用于PCR反应更加稳定 而且错误率更低 二 氧气 oxygen 微生物与氧的关系 厌氧菌的氧毒害机制 厌氧菌体内无SOD 超氧化物歧化酶 因此受生物体内普遍存在的超氧阴离子自由基的毒害作用 去除 O2 等有害活性氧分子的机制 三 pH值 嗜碱微生物 basophile 多数放线菌 硝化细菌 根瘤菌等耐碱微生物 basotolerantmicroorganism 若干链霉菌嗜酸微生物 acidophile 多数真菌耐酸微生
9、物 acidotolerantmicroorganism 乳酸杆菌 醋酸杆菌 许多肠杆菌等 第四节微生物培养方法概论 1 好氧菌的实验室培养 2 厌氧菌的实验室培养 高层琼脂柱 Hungate滚管 厌氧罐技术 厌氧手套箱 第五节有害微生物的控制 一 几个基本概念 1 灭菌 sterilization 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施 例如各种高温灭菌措施等 2 消毒 disinfection 消毒是一种采用较温和的理化因素 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌 而对被消毒的物体基本无害的措施 举例 一些常用的对皮肤 水果 饮用水进行药剂消毒的方
10、法 对啤酒 牛奶 果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法等 3 防腐 antisepsis 防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖 从而达到防止食品等发生霉腐的措施 防腐的常用措施低温缺氧干燥高渗高酸度防腐剂 4 化学治疗 chemotherapy 它是利用具有高度选择毒力 selectivetoxicity 即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性 的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖 借以达到治疗该传染病的一种措施 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂 一些重要的化学治疗剂种类 各种抗生素磺胺类药物中草药中的有效成分等 灭菌 消毒 防腐和化疗的比较 一 物理方法 高温杀菌
11、 烘箱内热空气灭菌法 150 170 1 2h彻底杀灭细菌 适用于金属和玻璃器皿的灭菌 火焰灼烧法 仅适用于接种环 接种针的灭菌或带病原菌的材料 动物尸体的烧毁等 干热灭菌法 1 热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强 2 热蒸汽比热空气穿透力更强 3 蒸汽存在潜热 当气体转变成液体时可放出大量热量 4 可迅速提高灭菌物体的温度 相同温度下 湿热灭菌比干热灭菌好 湿热灭菌法 干热与湿热空气对不同细胞的致死时间 巴氏消毒法 一种低温湿热消毒法 间歇灭菌法 fractionalsterilization 80 100 15 60min杀灭所有微生物的营养体 37 或室温保温过夜 诱发芽孢萌发为营养体 重复
12、上述步骤三次 在较低的灭菌温度下彻底灭菌 适用于不耐热培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌法 121 15 20min 1kg cm2是被广泛使用的方法 高压蒸汽灭菌锅构造 1 压力表2 安全阀3 放气阀4 软管5 紧固螺栓6 灭菌桶7 筛架8 水 手提式高压蒸汽灭菌锅 1 加水至止水线 2 灭菌物品包裹好 3 开启放气阀 4 加热排气 5 达到预定表压 开始计时 6 关闭热源 当压力降至0 05MPa时 缓慢开启放气阀 高压蒸汽灭菌锅使用方法 4 过滤 2 辐射 紫外线 电离辐射和强可见光等 3 干燥和渗透压 高渗 其他物理控制方法 过滤除菌 二 化学方法杀菌 1 表面消毒剂 surfacedisin
13、factant 是指对一切活细胞都有毒性 不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂 常用表面消毒剂及应用 影响消毒剂作用的因素 是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择性毒性的化学药剂 根据来源分为两类 人工合成 主要是一些生长因子类似物 磺胺类药物 微生物产生抗生素 2 化学治疗剂 chemotherapeutant 1 磺胺类药物 生长因子类似物 是第一个发现的生长因子类似物药物 也是人类第一个成功地用于特异性抑制某种微生物的生长来治疗疾病的化学治疗剂 对氨基苯甲酸 PABA 正常代谢物 磺胺 代谢物拮抗物 磺胺类药物的杀菌机制 PABA代谢类似物 二氢叶酸 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还
14、原酶 四氢叶酸 辅酶F 核酸合成 细菌体内合成叶酸 二氢蝶啶 二氢蝶酸 二氢蝶酸合成酶 二氢叶酸 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶 四氢叶酸 辅酶F 核酸合成 磺胺药 TMP TMP 三甲基苄二氨嘧啶 磺胺增效剂 细菌体内叶酸合成受阻 二氢蝶啶 二氢蝶酸 二氢蝶酸合成酶 PABA 假二氢叶酸 2 抗生素 antibiotics 一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物 它们在很低浓度时就能抑制或干扰他种生物 包括病原菌 病毒和癌细胞等 的生命活动 因而可用作优良的化学治疗剂 目前在临床上应用的抗生素仅五六十种 抗生素的抗菌谱 由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样
15、抗生素的作用对象就有一定的范围 这种作用范围成为抗生素的抗菌谱 抗生素的作用机制 抑制细胞壁合成 干扰细胞膜的功能 抑制蛋白质的合成 抑制核酸的合成 1 抑制细胞壁合成 TMP 磺胺药 PAPB 细胞膜 多粘菌素短杆菌肽 链霉素卡那霉素四环素 3 抑制蛋白质合成 红霉素氯霉素 2 抑制RNA合成 2 抑制DNA解旋酶 诺氟沙星新生霉素 主要抗生素和化学治疗剂的作用模型 利福霉素利福平 3 抑制蛋白质合成 4 干扰细胞膜合成 5 抑制细胞代谢 微生物的抗药性 抗药性主要通过遗传途径产生 如基因突变 遗传重组或质粒转移等 1 产生一种能使药物失去活性的酶 2 把药物作用的靶位加以修饰 3 形成 救
16、护途径 4 使药物不能透过细胞膜 5 通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外 微生物产生抗药性的原因 如何解决微生物的抗药性问题 筛选新的抗生素 对天然抗生素的结构进行改造 寻找比抗生素疗效更为广泛的生理活性产物 生物药物素 具有多种生理活性的微生物次生代谢物 酶抑制剂免疫调节剂受体拮抗剂抗氧化剂 解决方法 在微生物的培养过程中 如果要缩短其生长的延迟期 可以在菌种 培养基和其它方面采取哪些措施 细菌生长曲线分哪几个时期 各时期有何特征及在工业发酵中的应用 单细胞微生物的群体生长规律常分为哪四个时期 各有何特点 辨析题 分批培养时 细菌首先经历一个适应期 此期间细胞处于代谢活动的低潮 所以细胞数目并不增加 思考题 在微生物培养过程中 引起pH改变的原因有哪些 在实践中如何保证微生物处于较稳定和合适的pH环境中 根据下图中五类对氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态 分别写出它们的名称 思考题 思考题 推导在细胞的指数增长阶段细胞的传代时间G可由下式计算 G t lg2 lgXt lgX0 t为时间 Xt为t时刻的细胞数 X0为初始细胞数 好氧微生物液体培养主要有哪些形式 它
