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1、 作者 齐炜炜高国全 单位 中山大学中山医学院 第十二章 DNA合成 第一节DNA复制的基本规律 第二节DNA复制的酶学和拓扑学 第三节原核生物DNA复制过程 第四节真核生物DNA复制过程 第五节逆转录 重点难点 掌握DNA复制体系的组成 半保留复制的特点及其意义 掌握DNA复制的基本规律 DNA聚合酶的类型及功能特点 DNA复制的过程 原核DNA复制与真核DNA复制的主要区别 真核生物DNA端粒及端粒酶 非染色体DNA复制的其他形式 了解逆转录的发现发展了中心法则 DNA复制的基本规律ThebasiclawofDNAreplication 第一节 DNA复制的主要特征 半保留复制 semi
2、conservativereplication 双向复制 bidirectionalreplication 半不连续复制 semi discontinuousreplication 在复制时 亲代双链DNA解开为两股单链 各自作为模板 依据碱基配对规律 合成序列互补的子链DNA双链 一 DNA以半保留方式进行复制 半保留复制的概念 子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式半保留式混合式 密度梯度实验 含15N DNA的细菌 第一代 第二代 依据半保留复制的方式 子代DNA中保留了亲代的全部遗传信息 亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致遗传的保守性 是物种稳定性的分子基础 但不是绝对的 半
3、保留复制的意义 TCCATGACGGTGACC AGGTACTGCCACTGG TCCATGAC GGTGACC AGGTACTGCCACTGG TCCATGACGGTGACC CCACTGG AGGTACTG TCCATGAC AGGTACTG TCCATGACGGTGACC AGGTACTGCCACTGG 母链DNA 复制过程中形成的复制叉 子代DNA 二 DNA复制从起始点双向进行 原核生物基因组是环状DNA 只有一个复制起点 origin 复制从起点开始 向两个方向进行解链 进行的是单点起始双向复制 A 环状双链DNA及复制起始点B 复制中的两个复制叉C 复制接近终止点 termina
4、tion ter ori ter ABC 真核生物每个染色体又有多个起点 呈多起点双向复制特征 每个起点产生两个移动方向相反的复制叉 复制完成时 复制叉相遇并汇合连接 从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域称为复制子 replicon 复制子是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位 三 DNA复制以半不连续方式进行 领头链 leadingstrand 后随链 laggingstrand 沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的 这股链称为前导链 leadingstrand 另一股链因为复制方向与解链方向相反 不能连续延长 只能随着模板链的解开 逐段地从5 3 生成引物并复制子链 模板
5、被打开一段 起始合成一段子链 再打开一段 再起始合成另一段子链 这一不连续复制的链称为后随链 laggingstrand 沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段 Okazakifragment 四 DNA复制具有高保真性 半保留复制 确保亲代和子代DNA分子之间信息传递的绝对保真性高保真度DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复制保真性的机制之一 体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性 DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以及复制后修复系统对错配加以纠正 DNA复制的酶学和拓扑学EnzymologyandtopologyofDNAreplication 第二节 参与DNA复制
6、的物质 底物 substrate dATP dGTP dCTP dTTP聚合酶 polymerase 依赖DNA的DNA聚合酶 简写为DNA pol模板 template 解开成单链的DNA母链引物 primer 提供3 OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子 dNMP n dNTP dNMP n 1 PPi 一 DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合 全称 依赖DNA的DNA聚合酶 DNA dependentDNApolymerase 简称 DNA pol活性 1 5 3 的聚合活性2 核酸外切酶活性 核酸外切酶活性 3 5 外切酶活性 能辨认错配的碱基对 并将其水解5 3 外切酶活
7、性 能切除突变的DNA片段 一 原核生物有3种DNA聚合酶 DNA pol DNA pol DNA pol 原核生物的DNA聚合酶 个核心酶1个 复合物 6种亚基 1对 亚基 可滑动的DNA夹子 全酶结构包括 DNA聚合酶 全酶结构 亚基 130000 主要功能是合成DNA 亚基具有3 5 外切酶活性 复制保真性所必需 亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用 核心酶由 和 亚基组成 两侧的 亚基发挥夹稳DNA模板链 并使酶沿模板滑动的作用 2个 亚基分别和1个核心酶相互作用 其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动 分别负责合成前导链和后随链 功能 有促进全酶组装至模
8、板上及增强核心酶活性的作用 复合物由6种亚基组成 对复制中的错误进行校读 对复制和修复中出现的空隙进行填补 功能 DNA pol 109kD 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段 Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N端 C端 DNA pol Klenow片段是实验室合成DNA 进行分子生物学研究中常用的工具酶 DNA pol 120kD DNA polII基因发生突变 细菌依然能存活DNA pol 对模板的特异性不高 即使在已发生损伤的DNA模板上 它也能催化核苷酸聚合 因此认为 它参与DNA损伤的应急状态修复 一 常见的真核细胞DNA聚合酶
9、有5种 DNA pol 起始引发 有引物酶活性DNA pol 参与低保真度的复制DNA pol 在线粒体DNA复制中起催化作用DNA pol 合成后随链DNA pol 合成前导链 真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较 真核生物的DNA聚合酶 二 DNA聚合酶的碱基选择和校对功能 DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 遵守严格的碱基配对规律聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能复制出错时有即时校对功能 一 复制的保真性依赖正确的碱基选择 利用 错配 实验发现 DNApol 对核苷酸的参入 incorporation 具有选择功能DNApol 对不同构型糖苷键表现不同亲和力 因此实现其选择功能 二 聚
10、合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正 核酸外切酶 exonuclease 是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶 外切酶是有方向性的 A DNA pol的外切酶活性切除错配碱基 并用其聚合活性掺入正确配对的底物B 碱基配对正确 DNA pol不表现活性 DNApol 的校读功能 三 复制中DNA分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部 只有把DNA解成单链 它才能起模板作用 原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白质 一 多种酶参与DNA解链和稳定单链状态 解螺旋酶 helicase 利用ATP供能 作用于氢键 使DNA双链解开成为两条单链引物酶 primase
11、复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白 singlestrandedDNAbindingprotein SSB 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 解链过程中正超螺旋的形成 复制过程正超螺旋的形成 拓扑异构酶作用特点 既能水解 又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶分类及作用机制 拓扑异构酶 切断DNA双链中一股链 使DNA解链旋转不致打结 适当时候封闭切口 DNA变为松弛状态 反应不需ATP拓扑异构酶 切断DNA分子两股链 断端通过切口旋转使超螺旋松弛利用ATP供能 连接断端 DNA分子进入负超螺旋状态 拓扑酶的作用方式 四 DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口 连接DNA链3
12、OH末端和相邻DNA链5 P末端 使二者生成磷酸二酯键 从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链 DNA连接酶 DNAligase 作用方式 DNA连接酶的作用 功能 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用在DNA修复 重组及剪接中也起缝合缺口作用也是基因工程的重要工具酶之一 DNA聚合酶 拓扑酶和连接酶催化3 5 磷酸二酯键生成的比较 原核生物DNA复制过程DNAreplicationinprokaryotes 第三节 起始是复制中较为复杂的环节 在此过程中 各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体 形成复制叉并合成RNA引物 需要解决两个问题 1 DNA解开成单链 提供模板 2 形成引
13、发体 合成引物 提供3 OH末端 一 复制的起始 原核生物的复制起始部位及解链 此图有误需修改 此图错误部分包括文字和少了一个9bp重复序列已在图中标注 请编辑帮忙修改 DnaA DnaB DnaC DNA拓扑异构酶 引物酶 SSB 3 5 3 5 二 引物合成和起始复合物形成 含有解螺旋酶 DnaC蛋白 引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为起始复合物 起始复合物和复制叉的生成 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子 引物 引物酶 二 DNA链的延长 复制的延长指在DNA pol催化下 dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成
14、OH3 3 领头链的合成 领头链的子链沿着5 3 方向可以连续地延长 后随链的合成 在复制叉同时合成前导链和后随链 原核生物基因是环状DNA 双向复制的复制片段在复制的终止点 ter 处汇合 三 复制的终止 子链中的RNA引物被取代 真核生物DNA复制过程EukaryoticDNAreplicationprocess 第四节 真核生物与原核生物DNA复制的差异 真核生物复制子多 冈崎片段短 复制叉前进速度慢等DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseH和FEN1等 哺乳动物的细胞周期 DNA合成期 G1 G2 S M 细胞能否分裂 决定于进入S期
15、及M期这两个关键点 G1 S及G2 M的调节 与蛋白激酶活性有关蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用 真核生物每个染色体有多个起始点 是多复制子复制 复制有时序性 即复制子以分组方式激活而不是同步启动复制的起始需要DNA pol 引物酶活性 pol 和pol 参与 还需解螺旋酶活性 拓扑酶和复制因子 replicationfactor RF 一 真核生物复制的起始与原核基本相似 酵母复制起点为自主复制序列 autonomouslyreplicatingsequences ARS 酵母染色体含有多个复制起点 元件A 富含A T的共有序列 结合一个特异的蛋白质复合物 复制起点识别
16、复合物 ORC 3个序列 B1 B2和B3 可以增加复制起点的效率 其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同 酵母复制起始点 真核DNA复制叉主要蛋白质的功能 现在认为pol 主要催化合成引物 然后迅速被具有连续合成能力的DNApol 和DNApol 所替换 这一过程称为聚合酶转换 DNApol 负责合成后随链 DNApol 负责合成前导链 二 真核生物复制的延长发生DNA聚合酶转换 前导链 出现在引发后期后随链 发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶转换的原因是Pol 不具备持续合成能力DNA聚合酶转换的关键蛋白是RFC DNA聚合酶 转换 真核DNA聚合酶转换和后随链合成 3 5 5 3 前导链 3 5 3 5 亲代DNA 后随链 引物 核小体 三 真核生物DNA合成后立即组装成核小体 染色体DNA呈线状 复制在末端停止复制中冈崎片段的连接 复制子之间的连接染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物 去除后留下空隙 四 端粒酶参与解决染色体末端复制问题 切除引物的两种机制 线性DNA复制一次端粒缩短 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 端粒 telom
