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1、 颅内感染的实验室诊断技术新进展 1 1巢式PCR NestedPCR 本法需设计引物两套 对脑脊液进行两步法基因扩增 检测其中含量低的病原体 巢式PCR对革兰染色 培养或抗原检测阴性或不确定时更有检测价值 Takahashi等用巢式PCR检测脑脊液中含量甚微的结核分枝杆菌 较传统的PCR方法敏感度高出1000 10000倍 Failane等对疑有BCNI的儿童脑脊液应用半巢式PCR检测脑膜炎奈瑟菌 肺炎链球菌和流感嗜血杆菌 阳性和阴性预测值均为90 以上 TakahashiT NakayamaT TamuraM etal Nestedpolymerosechainreactionforass
2、essingtheclinicalcourseoftuberculous meningitis J Neurology 2005 64 10 1789 1793 FailaneL WagnerM CheskyM etal Simultaneousdetectionofnisseriameningitidis haemophihtsinfluenzaeandStreptococcussp bypolymerasechainreactionforthediagnosisofbacterialmeningitis J ArqNeuropsiquiatr 2005 63 4 920 924 1 2荧光
3、定量PCR Real TimeQuantitativePCRRT PCR RT PCR是常规PCR基础上加入荧光探针 具有准确性高 重复性好等特点 已广泛用于基因表达 病原体检测等领域 应用RT PCR检测细菌性脑膜炎的病原菌 阳性检出率 39 显著高于脑脊液培养 10 BrajonG MandasD LiciardiM eta1 Developmentandfieldtestingofareal timePCRassayforcaprinearthritis encephaliis Virus CAEV EJ3 J OpenVirolJ 2012 6 1 82 90 ChibaN Muray
4、amaSY MorozumiM etal RapiddetectionofeightcausativepathogensforthediagnosisofbacterialmeningitisbyrealtimePCR J JInfectChemother 2009 15 2 92 98 应用RT PCR检测脑脊液中肺炎链球菌 流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌敏感性和特异性分别达95 7 和94 3 且不受抗菌药物应用影响 研究表明 RT PCR的检测周期平均比传统PCR短24小时 有助于快速诊断 缩短患者住院时间并减少住院费用 WuHM CordeiroSM HarcourtBH etal Acc
5、uracyofreal timePCR GramstainandcultureforStreptococcuspnemoniae NeisseriameningitisandHaemoplilusinfluenzaemeningitisdiagnosis J BMCinfectionsDiseases 2013 13 4 26 35 DaheeJin MD TaeHoonHeo MD JungHyeByeon Analysisofclinicalinformationandreversetranscriptase polymerasechainreactionforearlydiagnosis
6、ofenteroviralmeningitis J KoreanJPediatr2015 58 11 446 450 1 3基于16SrRNA基因序列分析技术16SrRNA基因核苷酸序列具有高度保守性 存在于所有细菌的染色体基因组中 其在保守区之间有9 10个变异区 利用16SrRNA可变区与恒定区的特性 设计细菌通用引物 能对临床分离的任何病原菌进行准确鉴定和定位及不同种属细菌的分类 较传统的细菌培养有更高敏感性 应用16SrRNA基因扩增技术设计快速检测颅内感染常见病原菌的检测方法 能准确 快速且高效地检测脑脊液中病原菌 高通量测序技术与16SrRNA基因检测相结合 可以大幅度提高病原体检
7、测速度并降低检测成本 AliRezaMoayedi AbdolazimNejatizadeh MaryamMohammadian Accuracyofuniversalpolymerasechainreaction PCR fordetectionofbacterialmeningitisamongsuspectedpatients J ElectronicPhysician 2015 12 1609 1612 AicuiLiu ChaoWang ZhijuanLiang High throughputsequencingof16SrDNAampliconscharacterizesbacte
8、rialcompositionincerebrospinalfluidsamplesfrompatientswithpurulentmeningitis J DrugDesign DevelopmentandTherapy2015 94417 4429 1 4基因芯片检测技术 基因芯片技术是一种快速 高效 高通量的核酸分析技术 已广泛用于基因检测 药物或耐药基因的筛选 疾病相关基因的诊断 病原微生物感染的鉴定等领域 侯晓霖等通过NCBI数据库检索 筛选了包括脑膜炎奈瑟菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 表皮葡萄球菌及其他凝固酶阴性葡萄球菌等化脓性脑膜炎常见细菌的多条16S
9、rRNA序列特异性探针 覆盖脑膜炎常见病原菌90 的亚种 并根据临床流行情况变化进行探针增减来满足临床需求 侯晓霖 梁志娟 王振海 化脓性脑膜炎脑脊液常见病原菌基因芯片的构建 J 中国医科大学报 2013 42 1 14 18 刘志忠等应用基因芯片法检测临床脑脊液感染常见的10个种 属 病原菌 包括金黄色葡萄球菌 凝固酶阴性葡萄球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 肺炎克雷伯菌 鲍曼不动杆菌 阴沟肠杆菌 与传统细菌培养比较符合率为97 0 证实了芯片诊断技术筛查脑脊液病原菌的可行性 具有简便 快速 准确和高通量等优点 对临床样本检测及流行病学调查有重要意义 刘志忠 张艳 石广志 基因芯片法检测脑脊液
10、病原菌的临床应用 J CD 中华实验和临床感染病杂志 电子版 2013 6 3 210 213 2 1生物化学标志物2 1 1乳酸 LacticAcid 脑脊液乳酸是脑组织能量代谢的底物 是鉴别细菌性及病毒性颅内感染常用的生化标志物之一 细菌性感染时其含量升高 病毒性感染时无显著改变 MekitarianFilhoE HoritaSM GilioAE eta1 Cerebrospinalfluidlactatelevelasadiagnosticbiomarkerforbacterialmeningitisinchildren J hatJEmergMed 2014 7 14 MorichiS
11、 KasshiwagiY TakekumaK etal Expressionofbrainderivedneurotrophicfactor BDNF incerespinalfluidandplasmaofchildrenwithmeningitisandencephslitis enephalopathy J IntJNeurosci 2013 123 1 17 23 Sakushima等对有关脑脊液乳酸检测在细菌性颅内感染诊断价值的33个研究进行荟萃分析发现 脑脊液乳酸含量升高诊断细菌性颅内感染的合并敏感性为93 特异性为96 当脑脊液乳酸 35mg dL时 诊断的特异性可高达99 Sa
12、kushimaK HayashinoY KawaguchiT eta1 Diagnosticaccuracyofcerebrospinalfluidlactatefordifferentiatingbacterialmeningitisfromasepticmeningitis ameta analysis J JInfect 2011 62 4 255 262 2 1 2尿酸 UricAcid UA 脑脊液中的UA是由脑细胞中核酸转化而来的 因此脑脊液UA含量可作为脑细胞损伤的指标 发生颅内感染时 脑脊液UA含量显著增高 40 mol L 主要是由细菌感染致使脑细胞损伤 破坏 自身代谢增强所
13、致 同时也可能是由于炎症刺激使血脑屏障通透性增高 UA移行入脑脊液 使脑脊液中的UA增高 刘晓华 脑脊液中尿酸的测定及其在儿童病毒性脑炎中的意义 J 齐齐哈尔医学院学报 2008 29 8 944 2 1 3一氧化氮 NO 各种伤害性刺激均可诱发脑内各区NO含量明显升高 颅内感染患者脑脊液NO含量均高于正常 20mol L 但就细菌或病毒感染而言差异无统计学意义 P 0 05 NO升高幅度与脑损伤程度有关 与感染病因无关 N0含量测定有助于脑脊液常规 生化正常的颅内感染的诊断 2 1 4臭氧 ReactiveOxygenSpecies 细菌性脑膜炎患者CSF中臭氧含量明显高于非脑膜炎患者 其差
14、异具有统计学意义 便捷的臭氧检测方式是目前主要的研究方向 Anne ClaireLukaszewicz1 Val rieFaivre1 H l neBout MulticenterTestingoftheRapidQuantificationofRadicalOxygenSpeciesinCerebrospinalFluidtoDiagnoseBacterialMeningitis J Journal 2015 May 26 2 2脑脊液蛋白 细菌性颅内感染发生时 脑脊液中上述各种蛋白的含量 除胱抑素C外均较病毒性颅内感染时升高 而脑脊液胱抑素C水平则以病毒性颅内感染升高显著 脑脊液中新型蛋白
15、含量的测定因不受抗生素使用的干扰 为颅内感染病原菌的鉴别诊断提供了新的方向 JesseS SteinackerP LehnertS eta1 Aproteomicapproachforthediagnosisofbacterialmeningitis J PLoSOne 2010 5 4 e10079 TsaiHC ShiMH LeeSS eta1 Expressionofmatrixmetalloproteinasesandtheirtissueinhibitorsintheserumandcerebrospinalfluidofpatientswithmeningitis J ClinMi
16、crobiolInfect 2011 17 5 780 784 王艳 王谷声 周世俊 血清与脑脊液降钙素原检测在儿童中枢神经系统感染的应用 J 右江医学 2012 40 3 347 348 张丽琴 脑脊液免疫球蛋白 乳酸脱氢酶及腺苷脱氨酶检测在成人颅内感染鉴别诊断中的临床意义 J 中华医院感染学杂志 2012 22 8 1752 1754 2 2 1降钙素原 Procalcitonin PCT PCT是人类降钙素 calcitonin 的前体物质 1993年由Assicot等首次报道其可作为细菌感染的早期标志物 2001年国际脓毒症会议把PCT作为脓毒症诊断指标之一 与CRP WBC计数 中性粒细胞比例不同 在某些自身免疫性疾病 如类风湿病 PCT无明显增高 一般小于0 01ng mL Jereb等发现若以脑脊液PCT水平 0 5ng mL为阈值 其对细菌性脑膜炎和病毒性脑膜脑炎的阳性预测值分别为100 和74 还有学者研究认为血清PCT 0 05ng mL是诊断细菌性脑膜炎的指标 而局灶性感染和病毒性脑膜炎患者血清PCT水平一般不会高于此值 JerebM KotarT JureaT
