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1、福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度,实验目的,学习福林-酚试剂测定蛋白浓度的原理和方法掌握分光光度计和微量移液器的使用方法和用途 掌握什么是标准曲线，为什么制作标准曲线,实验原理,Folin-酚试剂法（Lowry法）第一步加碱性铜试剂 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物（双缩脲反应）,第二步再加入Folin-酚试剂。 在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团（酪氨酸）极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，生成钨蓝和钼蓝的混合物，可利用分光光度计测得其OD值,实验原理,第三步制作标准曲线1：为什么制作标准曲线 溶液蓝色深浅(即OD值）与蛋白质含量成正比，可测得已
2、知不同浓度梯度的蛋白质对应的OD值，根据浓度和OD值得回归方程即标准曲线，从而测得未知样品中蛋白质的含量。2：如何制作标准曲线 利用excele软件 如何制作？ 如何评估？,实验原理,试剂和器材,牛血清白蛋白溶液,碱性铜试剂,Folin试剂,可见光分光光度计,移液管,微量移液器,试剂的配制,碱性铜试剂,碳酸钠10g+氢氧化钠2g+酒石酸钠0.25g溶于500ml蒸馏水,：,= 1：50（V/V）,0.5g硫酸铜溶于100ml蒸馏水中,新鲜配制,Folin试剂,钨酸钠100g + 钼酸钠25g +蒸馏水700ml + 85%磷酸50ml + 浓盐酸100ml,回流蒸馏瓶,硫酸锂15g+ 蒸馏水5
3、0ml+溴数滴,定溶至1000ml,试剂的配制,实验方法,实验方法,以0号管为空白对照，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值（OD值）。注意事项：严格控制时间及时做好标记并且加一管之后把试管换一下位置；加Folin试剂时应迅速混匀，加一管混匀一管，以便在磷钼酸和磷钨酸试剂被破环之前即能发生还原反应；测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内。,结果与计算,根据测定的光密度值，绘制标准曲线： 每一点OD值取平均值，作为纵坐标，每管标准蛋白质含量（g）为横坐标，制作标准曲线回归方程，并评估标准曲线（R2值应在0.99以上) 做标准曲线时调零管的数据切莫忘记 即（0,0）点 由标准曲线，计
4、算待测蛋白质溶液的浓度：,DN/VODN/SV,蛋白质浓度（g/ml）=,1,2,分光光度计的原理,分光光度计的使用方法,开启电源，指示灯亮，仪器预热3分钟。 调节所需的波长，设置样品池个数空白对照管调零（一定放在离自己最近的那个样品池）将待测样品液放入比色皿（2/3高度），并将比色皿放入样品池内，盖好盖子，测光密度值（OD值），按上下键翻看其他样品池的数据测量完毕，一定把比色杯用自来水和蒸馏水重新洗净，倒置于滤纸上晾干,比色皿有光面和毛面，勿用触摸光面，使用时光面对准光路；盛液体时，需达到比色皿2/3左右；若液体不慎溢出，需用纸巾吸干 仪器如果沾有液体，请迅速擦干禁止用手甩比色皿，预防脱手摔
5、坏。,注意事项,微量移液器的使用,原理 微量移液器是根据“虎克定律”设计的，“在一定限度内弹簧伸展的长度与弹力成正比”：也就是微量加样器吸入液体的容量与加样器内的弹簧拉伸长度成正比。 常见种类 0.510l 550l 10100l 20200l(读数窗显示20200, 每转1档1l) 1001000l(读数窗显示1001000, 每转1档为5l),操作步骤,1：选择量程 根据转移液体的量，选择正确量程的微量移液器；2：调节吸量体积： 将微量移液器调至所需体积，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值；,3：吸量用移液器的吸杆插上合适的吸头，旋紧。握紧微量移液器，用大拇指按至第一档，将吸头插入溶液
6、中。然后松开大拇指，慢慢释放按钮以吸取液体（否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部）；然后将微量移液器移出液面。释放液体时，枪头接触在容器壁上，先慢慢按至第一档，停留12秒后，再按至第二档以排出所有液体。,操作步骤,4. 更换吸头： 吸取不同的液体，一定一定要更换枪头，防止试剂交叉污染，更换枪头时，对着废弃桶，轻轻按下卸载吸头的弹射器，吸头自然脱落在废弃桶内。5. 微量移液器的放置： 实验完毕后，将移液器调回到接近最大量程，使弹簧处于松弛状态，放到或者悬挂在架子上。,操作步骤,注意事项,1. 吸取不同的液体时，切记要更换吸头，2. 调节移液器时，动作要轻缓 ，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值，否则会造成损坏。3. 吸取液体时，动作要轻缓，防止液体随着气流进入移液器的上部；4. 带有残余液体吸嘴的移液器不能平放。5.每次实验完毕后将微量移液器调至接近最大刻度，使弹簧处于自然伸展状态。6.必须定期让专业人员进行校正，不能火烧灭菌，不能摔。,
