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1、绵阳师范学院 本科生毕业论文 设计 题 目 脂肪酶产生菌 M 6 2 发酵条件的优化 专 业 生 物 技 术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 姓 名 指 导 教 师 答 辩 时 间 2012 年 5 月 论文工作时间 2011 年 7 月 至 2012 年 5 月 脂肪酶产生菌 M 6 2 发酵条件的优化 摘 要 本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌 M 6 2的生长动力学和产酶动力学进行了研究 通过单因素实验和正交试验 对 脂肪酶产生菌M 6 2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化 得 出较佳的产酶培养基组成配方为 1 5 淀粉 0 5 酵母膏为碳源 4 5
2、 豆饼粉 1 5 硝酸铵为最佳的氮源 0 05 磷酸氢二钠和0 15 硫酸镁 最优的发酵条 件为 初始pH7 5 接种量1 5 装液量20ml 250ml 发酵温度35 在转速 180r min下 培养16h 经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15 60 U ml 较优化前提高了49 57 脂肪酶产生菌M 6 2与国内文献报道的产脂肪酶细菌 相比产酶活力高 对该菌株发酵条件进行优化后 为生产性试验打下了基础 关键词 脂肪酶产生菌 M 6 2 脂肪酶 发酵条件 优化 正交试验 Lipase to produce bacteria M 6 2 Optimization of fermentat
3、ion conditions Undergraduate Du Changman Supervisor Li Jun Gang Abstract In this paper Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M 6 2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied through single factor experiments and orthogonal test the lipase to
4、 produce bacteria M 6 2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula 1 5 starch and 0 5 yeast extract as carbon source 4 5 of the soybean powder and 1 5 ammonium nitrate for the best source of nit
5、rogen 0 05 disodium hydrogen phosphate and 0 15 magnesium sulfate Optimal fermentation conditions were initial pH 7 5 1 5 of the inoculum size liquid volume 20ml 250ml fermentation temperature 35 C in the speed 180r min next cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity c
6、an reach 49 57 to 15 60 U ml compared to before optimization Lipase to produce bacteria M 6 2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production Of the strain fermentation conditions optimized laid the foundation for the production of test K
7、ey words Lipase producing strain M 6 2 lipase fermentation conditions optimization orthogonal test 目 录 1 前言 1 1 1 脂肪酶的概况 1 1 2 国内外脂肪酶的研究概况 2 1 3 本研究的目的及意义 2 2 实验材料和器具 3 2 1 实验菌种 3 2 2 主要实验仪器 3 2 3 实验试剂 3 2 4 培养基 4 3 实验流程 4 4 实验方法 4 4 1 生长曲线的测定 4 4 2 产酶曲线的测定 5 4 3 脂肪酶产生菌 M 6 2 菌体生长的最佳条件的确定 5 4 3 1 PH
8、 对 M 6 2 菌体生长的影响 5 4 3 2 温度对 M 6 2 菌体生长的影响 5 4 3 3 装液量对 M 6 2 菌体生长的影响 6 4 3 4 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 6 4 4 脂肪酶培养基的优化 7 4 4 1 脂肪酶培养基单因素条件的优化 7 4 4 2 产脂肪酶培养基的正交试验 7 4 5 脂肪酶发酵条件优化 8 4 5 1 发酵条件单因素条件优化 8 4 5 2 产脂肪酶发酵条件的正交试验 9 5 分析方法 9 5 1 脂肪酶酶活测定与计算方法 9 5 2 酶活测定的原理 9 5 3 酶活的定义 9 5 4 酶活的测定 9 5 5 酶活的计算方法 9 5
9、6 生物量的测定 10 6 结果与讨论 10 6 1 生长曲线的测定结果 10 6 2 产酶曲线的测定结果 11 6 3 菌体的生长和产酶动力学关系 11 6 4 脂肪酶产生菌 M 6 2 菌体生长最佳条件的确定结果 11 6 4 1 PH 对 M 6 2 菌体生长的影响 11 6 4 2 温度对 M 6 2 菌体生长的影响 12 6 4 3 装液量对 M 6 2 菌体生长的影响 13 6 4 4 摇床转速对 M 6 2 菌体生长的影响 13 6 5 脂肪酶培养基的优化 14 6 5 1 单因素实验 14 6 5 2 正交试验 17 6 6 脂肪酶产生菌 M 6 2 发酵条件的优化 18 6
10、6 1 单因素实验 18 6 5 2 正交实验 21 6 6 讨论 22 参考文献 24 致 谢 26 精品毕业论文 1 前言 1 1 脂肪酶的概况 脂肪酶酶 EC 3 1 1 3 又称三酰基甘油酰基水解酶 acylglycerol hydrolases 1 是一类具有多种催化能力的酶 广泛存在于动植物 植物及微生物中 脂 肪酶具有多种催化能力 能够催化酯类的醇解 水解 转酯 酯化化及酯类的 逆向合成反应 2 3 4 5 6 除此之外 还表现出其他一些酶的活性 如磷脂酶 胆固醇酯酶 溶血磷脂酶 酰肽水解酶活性等 脂肪酶不同活性的发挥依赖于 反应体系的特点 如在油水界面促进酯水解 而在有机相中可
11、以酶促合成和 酯交换 它具有化学选择性和立体异构专一性 反应不需要辅酶 反应条件温 和 副产物少 因此被广泛的应用于轻纺 食品 皮革 化妆品 香料 医药 有机合成 洗涤剂 污水处理等 7 微生物脂肪酶种类多 易发生遗传与变异 繁殖快 pH 值范围及作用温度比动植物脂肪酶广 而且底物专一性高 而且微 生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶 便于工业生产以获得较高纯度的 酶制剂 已成为工业生产脂肪酶的主要来源 并在理论援救方面也具有重要的 意义 脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶 它可作用于甘油三酯的酯键 使甘油 三酯降解为单酯油酯 甘油二酯 脂肪酸和甘油 作为一种高效无污染的脱 脂剂 脂肪酶在皮革脱脂
12、工艺上尤其具有重要的用途 它可以把不易皂化 难 溶于水的脂肪分解为易溶于水的脂肪酸和甘油 且在碱性条件下使得脂肪更容 易从皮中除去 与传统的乳化法 皂化法和溶剂法脱脂相比较 酶法脱脂皮板 柔软 对皮革质量有明显的提高 脂肪酶还可以作为临床诊断胰腺炎 脂血病 等疾病的依据之一 市场上也已经有作血脂分析用的酶制剂出售 屠宰场 餐饮业 奶制品加工厂等产生的废水中富含易生物降解的有机物 和难生物降解的油脂 普通餐饮废水中油脂含量为 100 831 mg L 8 如果不 经处理直接排放 会造成环境的严重污染 油脂漂浮在水面形成油膜 阻碍氧 气传输 从而威胁水生动植物的生存 9 目前的油脂废水处理工艺有生
13、态处理 和生物处理 生物处理技术包括厌氧 好氧以及二者组合工艺 采用生物反应 器处理油脂废水时 油脂包裹在污泥表面 阻碍了传质作用 降低了底物转化 速率 10 此外 反应器中丝状菌大量繁殖 油脂附着在污泥表面 造成污泥沉 降困难 易导致活性污泥的大量流失 在上述情况下 反应器会出现恶臭气味 溢散和堵塞等运行问题 采用人工湿地等生态法处理油脂废水也很容易出现堵 塞现象 11 目前 成熟的油脂降解技术尚未出现 而国家规定的污水排放标准 日益严格 油脂废水处理技术的改进非常需要 对于饮食习惯中 油占重要部 分的国家 油脂废水处理难题尤为突出 由于微生物资源丰富 生产不受自然环境的影响 可用人工控制来
14、大量生 产目的酶 生产成本低 产酶周期短 是一种经济而实用的方法 脂肪酶在微 生物界分布很广 土壤是微生物的大本营 不同土壤中的微生物所产生脂肪酶 精品毕业论文 性能不尽相同 其产生菌主要是细菌和 霉菌 12 已经公布的适用于甘油三 酯加工的不同来源的脂肪酶有 33 种 其中 7 种是细菌 18 种是霉菌 目 前报道的用于产生脂肪酶的微生物主要有无根根霉 Rhizopus arrhizus 13 扩展 青霉 Penicillium expansum 14 假丝酵母 Candidarugosa 15 假单孢菌 Pseudomonas sp 16 等 其中从根霉菌中已分离到 30 多种脂肪酶 且有
15、多种根 霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂 17 1 2 国内外脂肪酶的研究概况 脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的合成和水解反应 这些反 应通常具有对映选择性 区域性或 高底物专一性 使脂肪酶成为有机合成中 重要的生物催化剂 近年来 微生物脂肪酶在各种不同行业得到了广泛的应用 主要是利用脂 肪酶的水解反应 水解反应是指脂肪酶催化脂肪或脂水解为其组成脂肪酸和甘 油或醇 以此应用脂肪酶的方面及行业包括 污水处理 脂肪酸提纯 脂肪水 解 甘油酯结构的测定 生产纸浆和造纸 皮革 加酶洗涤剂 医学应用 食 品成分 底纸脱墨等 其次 应用脂肪酶合成作用的包括低中相对分子质量聚 脂 脂 手性化合物的合成
16、 药物 油脂改性和化妆品等 2003年 中国极地研究中心的俞勇 18 等 从南极乔治王岛冻土来源的76 株 低温细菌中 筛选到13 株低温脂肪酶产生菌 并对其中的BTs10022 菌株进行 了鉴定和酶学性质的初步研究 2004 年邵铁娟 19 等对渤海海泥中筛选到的一株 产低温脂肪酶微生物进行了菌种鉴定及产脂肪酶发酵条件的研究 2006 年 张 金伟 20 等从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶菌株7195 并 对其进行了鉴定和初步分离纯化 其中南极假丝酵母脂肪酶B 的污水处理方面 用途最为广泛 该酶从南极假丝酵母 Candida antarctica 中分离得到 对非 水溶性和水溶性物质都有极强的催化活性 21 Cihangir 和Sarikaya 22 从土耳其 土样中分离了一株曲霉菌 在pH 5 5 温度30 下培养96 h 获得了酶活为 17U ml的脂肪酶 Azeredo 等 23 针对青霉菌展开液态发酵和固态发酵研究 在 pH 5 5 温度30 下液态发酵96 h 获得了酶活为12 U ml 的脂肪酶 而在湿度 70 温度30 下固态发酵24 h 获得了酶活为1
