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1、南京晓庄学院2012届本科毕业论文分 类 号： 学校代码：学 号：应用微波分离土壤放线菌 Application of Microwave for Actinomycetes Isolation from Soil 所在院： 学生姓名：指导教师： 研究起止日期：二一一年十二月至二一二年五月二一二年五月应用微波分离土壤放线菌 学生： 指导老师： 摘要：目的本文利用微波炉的微波对土样进行预处理，研究不同微波处理时间对分离放线菌效果的影响。方法土壤分别用微波处理0(CK）、3、6、9、12、15、18、21和24min。结果 1）微波处理能显著增加可培养放线菌数量,随着处理时间的增加，土壤放线菌比例
2、呈先增后减的趋势。处理3、6、9、12和24min,高氏1号及高氏2号培养基上放线菌比例较对照均有提高；处理1521min，放线菌比例较对照均有降低。2）随着微波处理时间的增加，土壤中稀有放线菌比例显著增加。结论微波处理能够增加放线菌的种类，有效提高稀有放线菌的比例。关键词：微波炉; 放线菌; 处理时间。Application of Microwave for Actinomycetes Isolation from SoilStudent : Lu YanSupervisor: Duan ShuRongAbstract: Objective To selectively isolate ac
3、tinomycetes the research applied microwave to pretreat the soil samples. Methods The soil samples was respectively pretreated with microwave in different time: 0 (CK), 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 and 24 min. Results 1) Microwave treatment can obviously increase cultivatable actinomyces quantity with the
4、 increase of processing time, at the same time the bacterial rate firstly increased and then decreased. Microwave treatment in 3, 6, 9, 12 and 24 min, actinomycetes numbers on GAUZEs medium no. 1 and no. 2 medium are both more than control; Then Microwave treatment in 15 to 21 min, actinomyces numbe
5、rs decreased considerably than control. 2) With the increase of microwave processing time, the rare actinomycetes rate increased significantly. Conclusion Microwave treatment can increase actinomyces variety and effectively improve rare actinomyces ratio.字典朗读显示对应的拉丁字符的拼音字典Key words：Microwave; Actino
6、mycetes; Selective isolation.目录前言51、材料及方法61.1、实验器材61.2、实验样品61.3、实验试剂61.4、分离培养基61.5、研究方法71.51、培养基的配制71.52、土样预处理71.53、分离计数72、实验结果与分析72.1、微波处理对放线菌数量的影响72.2、微波处理对稀有放线菌数量的影响92.4、结论12参考文献12致谢13前言放线菌因菌落呈放线状而得名，它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。土壤特有
7、的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。放线菌是一类具有重要经济价值和多种用途的微生物，自从1943年Waksman第一次从链霉菌中发现链霉素以后，又相继从链霉菌中发现土霉素、金霉素、氯霉素、红霉素等有显著医疗价值的抗生素，从此筛选新抗生素的工作广泛展开。实践证明，放线菌尤其链霉菌是产生抗生素种类最多的微生物。放线菌分类学伴随着抗生素事业的发展蓬勃发展起来，到现在已发现80多个属，仅链霉菌属就有1000多个种和变种。随着放线菌生物多样性研究的进展，放线菌仍然具有产生新的生物活性物质的极大潜力1。研究资料显示，目前人们分离到的放线菌仅占土壤所有放线菌的10%20%左右。放线菌在人工培养基上不生长的
8、原因很多，例如培养基养分不能满足某些放线菌的需求,非目的菌的抑制作用等，为了要分离到更多的放线菌，需要不断的改进分离方法。目前，国内外在放线菌分离方法研究方面已取得了较大的进展2-8。研究发现，采用多种物理、化学刺激以及改变培养基成分等措施8-10 , 能有效提高稀有放线菌的比例, 并分离出放线菌的新种属11-13。 微波是一种频率高、波长短的电磁波,其波长为1-1000mm，振荡频率为每秒24.5亿次, 微波的加热与杀菌作用已有大量研究,具有加热速度快、加热均匀性好、易于瞬时控制、选择性吸收和加热效率高的特点。 微波对生物体可以产生热效应、电效应、磁效应及化学效应等, 从而引起生物细胞多种生
9、理生化变化或致死效应14。微波技术已被广泛应用各行业中，如灭菌、物料干燥等行业14-18。 从物理学和生物学原理可推知，适度微波处理可能会促进放线菌孢子的萌发，使部分难培养放线菌的孢子在接受了一定量的微波辐射后萌发，转化为可培养放线菌，增加可培养放线菌的种类与数量。Bulina 等19将其应用于放线菌的分离,该研究发现，小功率、短时间微波处理效应对放线菌分离效果有一定影响，使用80W微波对土壤悬液处理30s 时能有效提高小单孢菌属、小多孢菌属、诺卡氏菌属及马杜拉菌属等稀有放线菌的比率。薛清等20研究了微波处理对钙质土壤放线菌分离效果的影响，发现微波处理对提高放线菌比例有促进作用。Li 等21使
10、用1kHz以上的极高频射线（EHF）对土壤悬液进行照射，发现在波长8-11.5时，各稀有放线菌总数较对照提高了7.5倍。 Likhacheva等22用超高频辐射法（SHF）对几种链霉菌孢子悬液进行不同时间的预处理，发现不同处理时间链霉菌的生物量以及活性均受到不同程度的影响。本文将微波炉的处理功率提高到800W，将处理时间设置为3、6、9、12、15、18、21和24 min，探讨了不同微波处理时间对放线菌分离效果的影响。1、材料及方法1.1、实验器材容量瓶、三角瓶、烧杯、试管、培养皿、量筒、移液枪及枪头、玻璃棒、涂布棒、玻璃珠、高、压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、摇床、微波炉、电炉、离心
11、管、吸纸、纱布、棉线、胶头滴管、pH试纸、天平、称量纸、药匙、95%酒精、报纸，搪瓷缸。1.2、实验样品2011年9月采自江西大鄣山不同生态系统类型和不同有机质含量的土壤（表层020）：土样1（T1）：大鄣山卧龙谷山行300400米处山坡草地；土样2（T2）：大鄣山乡东山坡枫香柏下1.3、实验试剂可溶性淀粉(Soluble starch) 国药集团化学试剂有限公司硝酸钾（KNO3） 上海久亿化学试剂有限公司磷酸氢二钾（K2HPO4） 上海久亿化学试剂有限公司七水合硫酸镁（MgSO47H2O） 江苏省连云港市化学试剂厂氯化钠（NaCl） 上海久亿化学试剂有限公司七水合硫酸亚铁（FeSO47H2O
12、） 上海久亿化学试剂有限公司琼脂(Agar) 福建泉州市泉港化工厂葡萄糖(C6H12O6) 西陇化工股份有限公司重铬酸钾(K2Cr2O7) 上海浦江化工厂 蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司 胰胨 北京奥博星生物技术有限责任公司复合维生素 上海信谊黄河制药有限公司1.4、分离培养基高氏1号培养基(1000ml)： 可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，七水合硫酸亚铁0.01g，琼脂 20g，重铬酸钾0.05g， pH7.27.4改良高氏2号培养基(1000ml)：葡萄糖1g,蛋白胨0.5g，胰胨0.3g，氯化钠0.5g，复合维生素(维生素B
13、1、核黄素、烟酸、维生素B6、泛酸钙、肌醇、p-氨基苯甲酸各0.5 mg，生物素0.25 mg)，琼脂 20g，重铬酸钾0.05g， pH7.27.41.5、研究方法1.51、培养基的配制a.将包扎好的培养皿、涂布棒等置于高压蒸汽灭菌锅中121灭菌20min。b.高氏1号培养基的配制：先将可溶性淀粉称好，在小烧杯内用50100ml水调成糊状。在瓷缸内加入900950ml热水，放在电炉上加热，将小烧杯内的淀粉倒入混匀。再分别称取其他药品，边搅拌边依次逐一加入，使之溶解，最后定容至 1000ml，调节pH7.27.4，分装。121高压蒸汽灭菌20min。高氏2号同上。c.在无菌超净台里，将培养基倒
14、入事先灭过菌的平皿，待冷凝成平板。1.52、土样预处理土样自然风干21d23-24,用灭菌研钵将土样碾磨过筛（孔径1mm），装入无菌广口瓶中。分别称取土样1和土样2各9份，每份为0.3g，置于离心管中，加入0.3ml无菌水润湿，放置15min后将离心管放入加有400ml自来水的烧杯中，置于800W，2450MHz的微波炉中，分别处理0(CK)、3、6、9、12、15、18、21和24min，用灭菌针管吸取无菌水冲洗土样，转入装有29.4ml无菌水的三角瓶中，震荡15min；制得10-2的土壤悬液。1.53、分离计数将处理好土壤悬液稀释成10-3倍 25，充分混匀，分别用移液枪吸取土壤悬液0.1
15、ml吹入高氏1号和高氏2号培养皿中，用涂布棒将土壤悬液均匀涂布整个培养皿，设3个重复。然后将其放入恒温箱28倒置培养21d。每7天观察一次，观察菌落生长情况,并记录培养皿中菌落的数量。 2、实验结果与分析2.1、微波处理对放线菌数量的影响表1 微波处理后T1各类微生物的数量Table.1 Numbers of all kinds of microorganism in T1 treated by microwave irradiation培养基处理时间(min）F(104个/g)B(104个/g)A(104个/g)A/SUM(%)高氏1号010.0 61.0 27.0 27.6 34.0 38.0 2
