《《农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化》-公开DOC·毕业论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化》-公开DOC·毕业论文（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、本科生毕业论文（设计）题 目: 农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化 姓 名: 学 院: 农学院 专 业: 农学 班 级: 学 号: 指导教师: 职称: 2011 年 5 月 15 日目 录 摘要3关键词3Abstract3Key Words31 材料与方法41.1 材料41.1.1 植物材料41.1.2 菌株和载体51.1.3 培养基51.1.3.1 农杆菌培养基51.1.3.2 烟草组织培养基51.1.4 主要试剂51.2 方法51.2.1 农杆菌介导法转化烟草51.2.1.1 受体材料准备51.2.1.2 农杆菌的培养61.2.1.3 农杆菌侵染外植体及培养61.2.2 转基因烟草的
2、分子鉴定61.2.2.1 转基因烟草DNA的提取61.2.2.2 PCR鉴定71.2.2.3 转基因烟草RNA的提取71.2.2.4 cDNA的合成81.2.2.5 RT-PCR检测82 结果与分析92.1 影响根癌农杆菌转化烟草的因素92.1.1 菌液浓度对转化效率的影响92.1.2 侵染时间对转化率的影响92.1.3 共培养时间对转化效率的影响102.1.4 预培养时间对转化效率的影响102.2 转基因植株的获得及分子检测（PCR、RT-PCR）112.2.1 转基因植株的获得112.2.2 转基因植株的分子检测113 讨论12致谢13参考文献13农杆菌介导GmftsH基因的烟草遗传转化摘
3、要：利用农杆菌介导的方法将GmftsH基因转入三生烟烟草中，将0.5cm0.5cm烟草外植体浸泡在培养好的农杆菌悬浮液中，震荡45分钟，然后置于MS1固体培养基上，在25的组织室内共培养2天，待再生幼苗根系发达后，将不定芽进行移栽从而获得了三生烟烟草转化植株。再经PCR检测，为阳性的植株均能扩增出与目的片断大小一致的特异性条带，初步表明GmftsH基因已经转到这些烟草基因组中。最后通过RT-PCR反应进行阳性转基因植株GmftsH基因在转录水平的检测，在转基因烟草中能够扩增出特异条带，而在野生型烟草对照中没有检测到特异条带，说明该基因在RNA水平上得到表达。关键词：GmftsH基因；烟草；农杆
4、菌；遗传转化；PCR鉴定GmftsH agrobacterium-mediated genetic tobacco genetic transformationAbstract：In the way of agrobacterium-mediated,putting GmftsH gene into Sansheng tobacco, then we make 0.5 cm x 0.5 cm tobacco explant soaked in cultivating good agrobacterium suspension, Concussing 4 to 5 minutes, then p
5、laced on MS1 solid medium, and Altogether training for two days in 25 organization indoor.After regeneration seedling root developed enough，transplanting adventitious bud thereby obtaining Sansheng tobacco conversion plants.PCR assay is the common way to validate the transgenic Plant, specific corre
6、sponding fragment was amplified by PCR detectionIt showed that GmftsH gene has been transferred into tobacco. Finally through RT - polymerase chain reaction, detecting positive GmftsH gene transcription of transgenic plants level, In transgenic tobacco could amplify specific bands, whereas in wild-t
7、ype tobacco control in the specific band was not detected, indicating that the gene was expressed at the RNA level.Key words: GmftsH gene；tobacco；agrobacterium；transformation; PCR assay在植物基因工程中，目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方法便是根癌农杆菌介导的遗传转化技术。在已获得的近200种转基因植物中约有80是由农杆菌介导完成的1。近年来，这种纯生物的方法由于具有转化率高，可导入大片段DNA，且导入基
8、因的拷贝数低，表达效果好，仪器和操作技术较简单等优点，引起了人们的极大关注2。该实验旨在建立农杆菌介导的高效快速的烟草遗传转化技术体系，为分子生物学和植物基因工程的研究提供较好的技术基础。而FtsH基因广泛分布于原核生物和真核生物中，其生物学功能也多种多样。FtsH基因与热激、高渗、光胁迫、冷诱导、病害等逆境胁迫有着不可分割的联系3-8，说明FtsH参与胁迫反应，但其确切的作用机制还不清楚，所以利用农杆菌介导的方法先将FtsH基因成功转入烟草中，可对FstH基因在烟草中的表达特性和生理功能的验证做良好的实验基础，为下一步的外源基因的遗传稳定性的检测也做了铺垫。1 材料与方法1.1 材料1.1.
9、1 植物材料烟草三生烟种子，将野生型烟草种子种植在营养土中，25条件下培养40-60天左右。1.1.2 菌株和载体本研究采用根癌农杆菌（EHA105）菌株为本实验室保存。植物过表达载体为pMDC-83，具有潮霉素抗性，可以进行初步筛选。1.1.3 培养基1.1.3.1 农杆菌培养基YEB培养基：酵母提取物（5g/l）+蔗糖（5g/l）+蛋白胨（5g/l）+七水硫酸镁（0.5g/l）+琼脂（15g/l）pH7.2。121高压灭菌锅灭菌 1.1.3.2 烟草组织培养基MS1（共培养）：即MS培养基pH7.2。121高压灭菌锅灭菌MS2（选择）：MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml
10、+头孢50ug/ml pH7.2。121高压灭菌锅灭菌MS3（生根）：1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA 0.2mg/ml pH7.2。121高压灭菌锅灭菌1.1.4 主要试剂（1）植物生长激素：6BA 200ug/ml，IAA 0.2mg/ml（2）抗生素：Hyg 50ug/ml，Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，头孢霉素50ug/ml（3）TE缓冲液(pH=8.0)：1ommol/Ltris-Cl(PH=8.0) lmmol/LEDTA(pH=80)（4）氯仿:异戊醇：按体积比24:1混合平衡氯仿和异戊醇，放于棕色试剂瓶中，4保存。（5）电泳缓冲液TAE（50）：每升含:
11、242克Tris碱；57.lml冰乙酸；10Om10.smol/LEDTA(PH=8.0)(使用缓冲液为1ATE)（6）植物总DNA提取试剂(2XCTAB，pH=8.0)：每升含：7.444克EDTA；12.114克Tris一Cl；80.2克Nael；20克CTAB1.2 方法1.2.1 农杆菌介导法转化烟草1.2.1.1 受体材料准备野生型烟草“三生烟”播种到营养土中，25培养40-60天左右。取完全展开叶片，将叶片先用灭菌蒸馏水清洗2-3次，再用70%的乙醇浸泡45秒，30%次氯酸钠或0.1%升汞消毒5分钟，转入超净工作台后用无菌水清洗4-5次，最后用灭过菌的滤纸吸干多余水分；用灭过菌的刀
12、片将烟草叶片切为0.5cm0.5cm大小作为外植体。注意：要保持叶片新鲜平整，切取外植体尽量避开叶脉9。1.2.1.2 农杆菌的培养(1) 挑取含有目的基因的单克隆，接种于YEB培养基上活化，单菌落接种于2ml的YEB液体培养基中（内含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28，200rpm振荡过夜。(2) 以1%的接种量接种于100mlYEB液体培养基中（内含Kan 50mg/L，Rif 25mg/L，Hyg 50mg/L），28，振荡培养至对数生长期（OD600=0.5）。(3) 无菌状态下，将培养好的菌液经过4000rpm(4)离心10分钟，弃去上清。(4)
13、 用20ml的MS1液体培养基重悬菌体沉淀，4000rpm(4)离心10分钟，弃去上清(5) 用20ml的MS1液体培养基再次重悬菌体沉淀，然后冰上放置，准备侵染野生型烟草的外植体之用。1.2.1.3 农杆菌侵染外植体及培养(1) 侵染 将外植体放入上述（5）的菌悬液中，震荡4-5分钟，使农杆菌与外植体伤口部位充分接触，将外植体从农杆菌悬浮液中取出，置于灭菌滤纸上吸干，然后置于MS1固体培养基上（叶片光滑面朝上），用封口膜封好后，在25的组培室共培养2天。(2) 共培养 将MS1培养基上的外植体转接到分化培养基MS2上（MS+6BA 200ug/ml+Hyg 50ug/ml+头孢霉素），25光
14、周期16h/18h，培养2-3周，其间每隔5天换一次分化培养基MS2，转接过程中注意要将叶片边缘侵入到分化培养基中，以便外植体吸收营养，而且转接当中要一直按照开始时转接的方式把叶片的光滑面朝上。(3) 选择培养 待愈伤组织分化成苗后用解剖刀切去整株的小植株转入装有分化培养基MS2的培养罐中，继续培养。(4) 生根培养 植株长大后，切去多余的愈伤保留整株的植株转入生根培养基中MS3（1/2MS+Hgy 50ug/ml+IAA 0.2mg/ml），让其生根。(5) 待再生幼苗根系发达后，开盖培养2-3天强化整株后，取出植株用无菌水清洗掉幼苗根部的琼脂再移栽到灭菌土的盆钵中放置于室温中培养。(6) 注意观察再生烟草的生长情况，注意浇水，开关灯等。1.2.2 转基因烟草的分子鉴定1.2.2.1 转基因烟草DNA的提取采用CTAB微量分离法提取烟草DNA（1）在50ml 离心管中加入20ml 2CTAB 提取缓冲液，65oC 预热。（2）取34g 新鲜的叶片，去掉主脉，在液氮中迅速研磨成均匀的粉末以后，把粉末倒入含有CTAB 缓冲液的离心管中，
