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1、精品 黑龙江东方学院本 科 生 毕 业 论 文（设 计）牛乳中抗生素残留的检测姓 名 学 号 专 业 食品科学与工程 班 级 指导教师 学 部 食品与环境工程 答辩日期 年5月24日 牛乳中抗生素残留的检测摘 要本实验采用国标TTC法，纸片法和试剂盒法三种微生物方法对哈尔滨市大型超市中不同品牌的13种牛奶进行抗生素检测,并对三种微生物法进行比较。实验结果证明：快速检测法比TTC法和微生物纸片法的灵敏度要高，国标TTC法检测结果不是很准确；纸片法虽然较准确但前序工作所耗时间特别长。本研究通过三种微生物法的检测结果的比较，为抗生素残留快速检测方法的补充提供理论依据。关键词:抗生素；TTC；纸片法；
2、试剂盒Test the Antibiotics Survival in MilkAbstractThere are three methods in this experiment .They are GB TTC method, disk method and detection met.The experiment is testing the antibiotics survival in milk.The 13 kinds of milk in different brands of large supermarkets,and comparing the three methods
3、in harbin. The result of experimental show that: rapid detection method is more sensitive than GB TTC method and disk method, but GB TTC method moreexact than.Though the disk method is more correctly,its pre-arranges time is ionger than others. In this study, through the comparing in the results of
4、three microbiological methods, it provides a theoretical basis for the supplement to rapid detection of antibiotic survival.Key words: antibiotics; TTC; disk method; detection met目录摘 要iAbstractii第1章 绪 论11.1 抗生素简介11.1.1抗生素的概念11.1.2抗生素的分类11.2 牛奶中抗生素残留的危害及其产生的原因21.2.1牛奶中抗生素残留的危害21.2.2牛奶中抗生素残留产生的原因31.3
5、牛奶中抗生素残留的现状31.4 牛奶中抗生素残留检测研究进展41.4.1 微生物检测法41.4.2理化检测法51.4.3快速检测试剂盒61.5 本实验研究的目的与意义7第二章 实验材料和方法82.1 实验材料82.1.1材料82.1.2 主要仪器和设备102.2 试验方法102.2.1 原料预处理102.2.2 TTC法132.2.3试剂盒法132.2.4 纸片法13第三章 结果与讨论153.1判定方法与结果153.1.1 TTC法153.1.2 试剂盒法163.1.3纸片法173.2 结果统计183.3 方法比较183.3.1从检测时间183.3.2从灵敏度上183.3.3 应用场所193.
6、3.4判定结果的方便性19结 论20参考文献21致 谢22精品第1章 绪 论牛奶是最接近“完善”的食品，它含有丰富的动物蛋白质和人体需要的氨基酸、维生素、矿物质、钙质、脂肪、糖类等多种营养成分，所以它不仅是新生儿天然的全营养食品，也是男女老少理想的营养食物。因此，各个国家对牛奶的质量与安全问题十分重视，与此同时，在检测技术上各国都进行大量的研究。随着抗生素在乳畜饲养业中的广泛应用，牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视1。对此，检测技术也迅速发展，以寻求简便、快速、准确、敏感性高的检测方法满足日趋严格的残留限量要求，保证人们引用牛奶的卫生和安全。1.1 抗生素简介1.1.1抗生素的概念 由
7、微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类代谢物，以及甚至用化学方法合成或半合成的化合物。1.1.2抗生素的分类 抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。自1940年以来，青霉素应用于临床，现抗生素的种类已达几千种。在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。其分类有以下几种：（一）-内酰胺类青霉素类和头孢菌素类的分子结构中含有-内酰胺环。近年来又有较大发展，如硫酶素类、单内酰环类，-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类等。（二）氨基糖甙类包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素
8、、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。（三）四环素类包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。（四）氯霉素类包括氯霉素、甲砜霉素等。（五）大环内脂类临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等。（六）作用于G+细菌的其它抗生素，如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。（七）作用于G菌的其它抗生素，如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。（八）抗真菌抗生素如灰黄霉素。（九）抗肿瘤抗生素如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。（十）具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。1.2 牛奶中抗生素残留的危害及其产生的原因1.2.1牛奶中抗生素残留的危害1.2.
9、1.1 产生过敏反应 由于一般的抗生素对热的稳定性高，牛奶加热杀菌无法将其破坏，所以混有抗生素的牛奶加工成奶制品后仍有大量的抗生素残留2，如果经常饮用此种牛奶，将反复受到抗生素的刺激而发生致敏。有报道称，一对青霉素高度敏感的病人，在食用含抗生素约 10 IU/mL 的商品奶后，发生了变态反应3。1.2.1.2 产生耐药性菌株 人类经常食用含抗生素的奶制品，某些细菌因长期接触抗生素而产生了耐药性，当机体发病时，因耐药菌株的存在而使治疗效果下降或完全失效，从而危及病人生命。1.2.1.3 造成人体肠道内的菌群失调 正常情况下，人体内的菌群维持在一个平衡状态，但当长期接触含抗生素残留的牛奶时，此种平
10、衡状态将会遭到破坏，引起胃肠疾病和生理紊乱，如造成维生素缺乏和紫癫性损伤。1.2.1.4 其他危害 此外牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质，如果用含抗生素的原料奶生产酸奶或奶酪等，则残留的抗生素将会抑制细菌的发酵，降低产量和质量，给生产者造成经济损失。1.2.2牛奶中抗生素残留产生的原因1.2.2.1 对泌乳期奶牛的用药治疗 对泌乳期奶牛用药不当或不注意安全时间是造成牛乳中抗生素残留的重要原因，尤其是采用乳房灌注治疗奶牛乳房炎时，更易造成牛乳中抗生素的残留。美国食品和药品管理局（FDA）调查结果表明，用药不当是造成牛乳中抗生素残留的主要原因4。1.2.2.2抗生素作为奶牛饲料添加剂使用 在饲料中
11、添加抗生素，可有效抑制或杀灭畜体内的有害微生物，维持畜体胃肠道微生物的平衡，从而促进动物的健康，提高其生产性能但是，奶牛如果长期食用含抗生素的饲料，很容易造成牛奶中抗生素残留，这也是造成牛奶中抗生素残留问题的一个重要原因。1.2.2.3受到抗生素污染的挤奶工具和贮奶用具 某些奶牛场由于操作不规范，在尚未彻底清洗和消毒患乳房炎的奶牛使用过的挤奶工具和贮奶设备情况下，用于其它健康牛只，造成抗生素残留问题。1.2.2.4 在牛奶中加入抗生素防止牛奶腐败 一些不法交奶户在高温季节为了防止牛奶酸败，在牛奶中掺杂各种抗生素通过抑制细菌生长以达到防止牛奶酸败，保持牛奶品质的目的，这也是牛奶中抗生素残留的一个
12、重要原因。1.3 牛奶中抗生素残留的现状牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视5。联合国粮农组织（FAO）和世界卫生健康组织（WHO）早在 1969 年就提出，应对各种动物性食品中的抗生素残留规定允许标准，并建议在奶牛接受抗生素治疗停药后至少 3d（最好 57d）的牛奶不能作为食用奶的原料。欧美国家多年前即已明文禁止抗生素残留超量的牛奶上市（对青霉素类药物的限量为 410g/kg）。我国虽然也颁布了相关管理条例，但是由于各种原因牛奶中抗生素残留问题依然十分严重。丁洁等在2003 年对南京市牛奶中抗生素残留进行了调查6，发现消毒牛奶、奶粉、婴幼儿奶粉和生牛奶的阳性率分别为13.3% 、37.
13、8% 、34.4% 、3.2% ；广州市卫生防疫站对广州市牛奶中抗生素残留进行监测，结果如下：消毒牛奶、奶粉、婴幼儿奶粉和生牛奶的阳性率分别为21% 、39% 、44% 、60% 。可见国内市场中牛奶抗生素超标现象十分严重，应引起社会重视7。1.4 牛奶中抗生素残留检测研究进展1.4.1 微生物检测法微生物检测法测定原理是根据抗生素对微生物的生理代谢作用的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗生素的残留8，如纸片法（PD法），TTC 法，拭子法（STOP）等。微生物法具有费用低，操作简便，可靠性高等特点。但该方法必须经过几个小时才能观察到结果，测定的结果与试验菌株的敏感性，琼脂平板中的试验菌株数，
14、培养基及其成分的pH值有关，且通过肉眼判断显色状态，容易产生误差。目前常用的两种方法是纸片法（PD法）和TTC 法。1.4.1.1纸片法 常用的纸片法包括枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片法9，主要用于检测牛奶中的-内酰胺类抗生素。枯草杆菌纸片法只适用于-内酰胺类抗生素的检测，检测限为0.01IU/mL，而嗜热脂肪杆菌纸片法不仅适用于-内酰胺类抗生素的检测，他还可检测到奶样中其它抗生素的存在，检测限为0.008IU/mL。1.4.1.2 TTC 法 TTC 法，即氯化三苯四氮唑试验，它是目前我国食品卫生标准中规定的检测牛奶中抗生素残留的检测方法10。此方法为向检样中加入嗜热乳酸链球菌和 TTC
15、试剂，通过观察显色状态的变化判定检样中有无抗生素存在。乳样中有抗生素存在，则在向检样中加入菌液培养时细菌不增殖，此时由于加入的指示剂 TTC 不还原，所以不显色。相反，如果没有抗生素存在，则加入菌液即进行增殖，TTC 被还原而显红色。也就是说当检样呈乳的原色时为阳性，微红色是为可疑，桃红色或红色时为阴性。目前 TTC 法检测的各种抗生素灵敏度如下：青霉素为0.004单位、链霉素0.5单位、庆大霉素0.4单位、卡那霉素5单位。1.4.1.3 DelvotestSP（ 戴尔沃检测法） DelvotestSP 检测法是由荷兰 Gist-brocades BV 公司开发的。其与先前的 DelvotestSP相似，但用时更短，只需培养 2h，对青霉素的检测灵敏度提高到 0.003-0.0
