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1、项目类型省种业项目项目编号福建省农业科学院科研项目季度研究报告正交设计优化莲雾ISSR-PCR反应体系项目类型:福建省种业创新与产业化工程项目项目名称：福建莲雾品种创新应用及产业带工程建设承担单位：果树研究所作者姓名：张立杰通讯作者:许家辉联系电话：15880085925电子邮箱：Bluesky_福建省农业科学院2012年4月目 录摘要11、项目背景12、研究概述13、材料与方法14、结果与分析15、讨论16、参考文献27、知识产权28、致谢2正交设计优化莲雾ISSR-PCR反应体系张立杰 许家辉福建省农业科学院果树研究所摘要本研究以莲雾(Syzygium samarangense Merr.
2、et Perry)品种农科一号为试材，采用经改良的CTAB法提取莲雾叶片的DNA，探讨了Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq聚合酶、模板DNA用量对莲雾ISSR-PCR的影响。建立了总体积为25L的莲雾ISSR-PCR反应体系：Mg2+ 浓度为3.0 mmolL-1dNTP浓度为0.2mmolL-1primer浓度为0.4molL-1Taq DNA聚合酶1.5 U模板DNA含量为30 ng，并含2.0L10PCR Buffer（Mg2+ free）:。应用该反应体系对农科一号和农科二号进行ISSR-PCR扩增，共筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物，该体系的构建将对进一步开展莲雾的
3、资源鉴定和分子育种工作提供技术支持。1、项目背景本项目来源于福建省种业创新与产业化工程项目“福建莲雾品种创新及产业带工程建设”的专题三 “莲雾品种创新与良种配套栽培技术集成与推广”，专题主持人：许家辉，主要参加人员：叶新福、余东、魏秀清、章希娟、张立杰、许玲、张丽梅、周丹蓉、陈志峰。项目总经费1500万元，实施年限：2011.12013.12。项目主持单位福建省农业科学院，专题执行单位：福建省农业科学院果树研究所。2、研究概述莲雾（Syzygium samarangense Merr. et Perry）， 又名洋蒲桃、爪哇蒲桃等， 为桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃属植物，是著名的热带、亚
4、热带水果之一。莲雾原产于马来半岛及安达曼群岛，我国最早于17世纪由荷兰人自爪哇引入我国台湾，约于100多年前引入广东、福建、海南等地，目前以台湾栽培最多，并成为台湾最重要的经济果树之一（韩剑等，2007）。目前福建省的莲雾生产仍处于零星栽培，品种良莠不齐，且多以莲雾果实的色泽进行命名，极有可能造成同名异物和同物异名，这对福建省莲雾资源的收集与利用、莲雾产业的发展，带来了极大的不便。近年来，基于DNA-PCR的ISSR分子标记技术由于具有操作简单、多态性高、 重复性和稳定性好及不需预先知道靶序列的信息等优点，已成为研究者优先选择的标记技术。但利用该技术时，PCR扩增效果易受到诸如Mg2+浓度、d
5、NTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA和引物浓度等多因素影响，因此有必要预先建立与研究材料相适合的反应体系。正交试验设计具有均衡分散、综合可比、可伸可缩、效应明确、能够较快地找到最优组合等优点，已在多种植物的ISSR-PCR反应体系优化中被采用（周凌瑜等，2008；杨培奎等，2010；武创等，2010；王佳等，2006）。但ISSR标记在莲雾上的应用报道较少（何桥等，2006），而有关采用正交试验设计方法优化莲雾ISSR反应体系的研究尚未见报道。本试验首次利用正交试验设计方法，探讨建立莲雾的最佳ISSR-PCR反应体系，并对ISSR引物进行了多态性筛选，为进一步开展莲雾的资源鉴定和分子育种
6、工作提供技术支持。3、材料与方法3.1材料供试材料为莲雾品种农科一号、农科二号幼叶，于2011年9月采自福建漳州长泰雪美果蔬场。用于ISSR-PCR反应的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶等购自TaKaRa公司，引物由上海生物工程有限公司合成。3.2 方法3.2.1 基因组DNA的提取 采用改良CTAB法提取基因组DNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度计检测浓度和纯度，将DNA稀释至30ngL-1，-20保存备用。3.2.2 ISSR-PCR反应因素水平确定及正交表设计针对影响PCR反应的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和酶5个因素，选用L16(45)正交表在4
7、个水平上进行试验(表1)。以UBC881 (GGGTG)3为试验引物，用莲雾农科一号品种DNA作为模板。将表2的每个处理重复2次，各处理PCR反应体系总体积为25L。在TECHNE Touchgene Gradient 型PCR扩增仪上进行扩增，扩增程序为： 95预变性5 min；94变性 60 s，55退火 45 s，72延伸90 s，共30个循环；72最后延伸7 min，4保存。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，在培清JS-780凝胶成像仪上成像检测。表1 ISSR-PCR反应体系的因素与水平Table 1 Factors and levels of ISSR-PCR reac
8、tion systems水平Levels模板DNA（ng25L-1）Template DNA（ng25L-1）引物(molL-1)Primer(molL-1)Mg2+( mmolL-1)dNTPs(mmolL-1)Taq(U)1300.11.50.20.52600.22.00.31.03900.32.50.41.541200.43.00.52.0表2 ISSR-PCR反应的正交试验设计表L16(45)Table 2 L16(45) orthogonal design for ISSR-PCR处理Treatment因素 Factor模板DNA（ng25L-1）DNA template（ng25L
9、-1）引物(molL-1)Primer(molL-1)Mg2+( mmolL-1)dNTPs(mmolL-1)Taq(U)1300.11.50.20.52300.22.00.31.03300.32.50.41.54300.43.00.52.05600.12.00.42.06600.21.50.51.57600.33.00.21.08600.42.50.30.59900.12.50.51.010900.23.00.40.511900.31.50.32.012900.42.00.21.5131200.13.00.31.5141200.22.50.22.0151200.32.00.50.516120
10、0.41.50.41.03.2.3 数据统计依扩增条带的敏感性、特异性和清晰性即条带强弱、杂带的多少和背景深浅对每个处理的2个重复作116分计分（何正文等，1998），分数越高，表示敏感性、特异性越好。采用穆立蔷等（2006）的方法求出每个因素同一水平下的得分总和Ki及平均值ki，并求出同因素不同水平间的极差R，最后对各因素不同水平的结果均值ki用Excel作图分析，确定各因素的最佳用量或浓度水平。3.2.4 引物筛选和退火温度的确定根据正交试验结果，应用最佳反应体系从60条引物中筛选出多态性丰富的引物。根据所选引物序列计算理论退火温度Tm，Tm 4(G+C) + 2(A+ T)，对每个引物的
11、退火温度进行梯度试验，设定了8个梯度：50.2、51.5、52.2、52.8、54.2、54.9、54.9、55.6。每个梯度设2个重复，除退火温度不同外，反应程序与正交试验设计的相同。3.2.5循环次数的确定及最佳体系验证根据正交试验结果，选择最佳反应体系和最适退火温度对循环次数进行5个梯度试验： 30、35、38、40、45次，每个梯度设2个重复。ISSR-PCR反应体系及扩增程序的优化结果经过农科一号、农科二号2个不同莲雾品种反复验证以确定其在实验应用中的稳定性和优越性。4、结果与分析4.1 PCR正交试验设计直观分析引物UBC881正交试验PCR产物电泳结果见图1，16个组合均有谱带产
12、生，由于引物浓度、dNTPs、Mg2+、DNA模板及Taq DNA聚合酶5种影响因素组合的不同，扩增效果存在明显差异，其中第4组合和第8组合扩增效果最好。依据扩增条带的强弱、杂带的多少和背景的深浅对PCR扩增结果依次打分。条带数量丰富、清晰、稳定的最佳产物计16 分，最差的计1分。 2 次重复分别独立统计，16个组合的分数依次为： 1，8； 8，9；14，12；16，16；6，4；4，2；12，14；15，15；3，5；10，11；2，6；13，13；7，7；9，10；5，3；11，1，根据打分求出每个因素同一水平下的试验值之和Ki以及每一因素水平下的数据平均值ki ，并求出同一因素不同水平间
13、平均值的极差R（表3）。应用SPSS 17.0软件对上述处理结果进行差异显著性分析（表4）。表3 正交设计直观分析Table 3 Intuitive analysis of orthogonal design结果Rseults模板DNA template引物PrimerMg2+dNTPsTaqK142.020.517.540.034.0K236.031.530.534.531.5K331.534.041.534.536.0K426.550.046.527.034.5k110.55.14.410.08.5k29.07.97.68.67.9k37.98.510.48.69.0k46.612.511
14、.66.88.6R3.97.47.23.21.1表4 各因素不同处理水平结果均值差异显著性表Table4 Significance between the result mean of the different for factor levels因素Factor水平1Level 1水平2Level 2水平3Level 3水平4Level 4模板DNADNA template10.51.06a9.00.35ab7.91.24ab6.61.94b引物 Primer5.11.24c7.90.18bc8.50.36b12.51.77aMg2+4.40.18d7.60.53c10.40.21b11.60.5
