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1、主编：邱 爱 东2011-2012 第一学期分 子 生 物 学 实 验 讲 义编者按：分子生物学是一门动手性很强的实验科学，本科教学中的实验环节对学生从课堂理论到科研实践起到非常重要的衔接作用。为了更好的帮助学生理解分子生物学的基础理论，培养科研活动中的实际操作能力，并根据我校现有的实验基础条件，编者挑选出最具代表性的基础实验内容，编写了这本分子生物学实验讲义 。仅供我校生物工程、药学、制药工程等本科专业学生使用。目 录实验一 碱裂解法小量提取质粒 DNA实验二 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳实验三 质粒的酶切和鉴定实验四 聚合酶链反应PCR实验一 碱裂解法小量提取质粒 DNA1、原理细菌质粒
2、（plasmid）是一些双链，闭环的 DNA 分子，其大小范围从 1kb到 200kb 以上不等。是独立于细胞染色体之外能自主复制的遗传成份，多存在于原核生物细胞中，是目前基因克隆中最常用的载体分子。碱裂解法是最常用的提取质粒 DNA 的方法，可得到质粒 DNA 的粗提液；通过进一步纯化可得到较纯的质粒 DNA。从细菌中分离质粒 DNA 的方法包括 3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解菌体；分离和纯化质粒 DNA。离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液）悬浮菌体，采用碱性 SDS(十二烷基磺酸钠）溶液（溶液）裂解菌体细胞壁，使质粒缓慢释放出来。在碱性条件下，双链 DNA 变成
3、单链，当 PH 调至中性并有高盐浓度存在下，绝大多数变性质粒恢复自然状态溶在液体中；而变性的细菌染色体 DNA 会相互交联缠绕附着在细胞碎片上，与蛋白质形成沉淀。离心获得含有大量质粒的上清液，再利用适当浓度的亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇、PEG8000）使质粒 DNA 脱水，离心得到质粒沉淀。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了 超螺旋 DNA 外，还会产生其它形式的质粒 DNA。如果质粒 DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环 DNA(Open circularDNA，简称 ocDNA)；如果质粒 D
4、NA 的两条链在同一处断裂，则形成线状 DNA(LinearDNA)。当提取的质粒 DNA 电泳时，同一质粒 DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 二、材料、试剂及仪器1. 材料： 含 PBS 的 E.coliDH5 或 JM 系列菌株。2. 试剂：1）LB 液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g， 酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl 10g，溶于 800ml 去离子水中，用 NaOH 调 pH 至 7.5，加去离子水至总体积 1 升，高压下蒸气灭菌 20分钟。 2）LB 固体培养基：液体培养基中每升加 12g
5、 琼脂粉，高压灭菌。 3）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成 50mg/ml 水溶液，-20保存备用。 4）溶菌酶溶液：用 10mmol/LTrisCl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如 1.5ml）保存于-20，每一小份一经使用后便予丢弃。 5）3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml 水中溶解 40.81gNaAc3H2O，用冰醋酸调 pH 至 5.2，加水定容至 100ml，分装后高压灭菌，储存于 4冰箱。 6） 溶液50ml：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/ L TrisCl（pH8.0） ，10mmol/L EDTA（pH8.0）
6、。溶液可成批配制，每瓶 100ml，高压灭菌15 分钟，储存于 4冰箱。 7）溶液100ml：0.2mol/LNaOH（临用前用 2mol/L NaOH 母液稀释），1%SDS（W/V，临用前用 10%SDS 母液稀释） 。现用现配。8）溶液 100ml：5mol/L 乙酸钾 60ml，冰醋酸 11.5ml，H 2O 28.5ml，定容至 100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K + 3mol/L，Ac - 5mol/L。 9）RNase 母液：将 RNA 酶溶于 10mmol/L TrisCl（pH7.5） ，15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100加热 15
7、 分钟，使混有的 DNA酶失活。冷却后用 1.5mleppendorf 管分装成小份保存于-20。 10）Tris 饱和酚（PH7.0):氯仿:异戊醇 = 25:24:1(V/V/V） ，氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过 程中出现的泡沫。11）TE 缓冲液：10mmo/L TrisCl（pH8.0） ，1mmol/L EDTA（pH8.0） 。高压灭菌后储存于 4冰箱中。 3. 仪器：微量移液器（20l，200l，1000l） ，制冰机、37恒温摇床、台式高速离心机，高压蒸汽灭菌锅，涡旋振荡器，超净台、电子天平，1.5ml塑料离心管（又称 eppendorf
8、管，EP 管） ，离心管架等。三、操作步骤 1.细菌的培养和收集： 将含有质粒 pBS 的 DH5 菌种接种在 LB 固体培养基（含50g/mlAmp）中，37培养 1224 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5mlLB 液体培养基（含 50g/ml Amp）中，37振荡培养约 12 小时至对数生长后期。 2.碱法小量提取质粒 DNA 1）取 1.5ml 培养液倒入 1.5mlEP 管中，4下 12000g 离心 30 秒。 2）弃上清。 3）菌体沉淀重悬浮于 100l 溶液中（需剧烈振荡） ，室温下放置510 分钟。 4）加入新配制的溶液200l，盖紧管口，快速温和颠倒 EP 管数次，以混匀
9、内容物（千万不要振荡） ，冰浴 5 分钟。 5）加入 150l 预冷的溶液，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒，使沉淀混匀，冰浴中 510 分钟，4下 12000g 离心 510 分钟。 6）上清液移入干净 EP 管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1） ，振荡混匀，4下 12000g 离心 5 分钟。 7）将水相移入干净 EP 管中，加入 2 倍体积的无水乙醇，振荡混匀后 置于-20冰箱中 20 分钟，然后 4下 12000g 离心 10 分钟。8）弃上清，加入 1ml70%乙醇洗沉淀一次，4下 12000g 离心 510分钟。 9）吸除上清液，真空干燥 10 分钟或室温干燥。 10）将沉
10、淀溶于 20l TE 缓冲液（pH8.0，含 20g/mlRNaseA）中，储于-20冰箱中。 注意1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒 DNA 过程中除去蛋白质很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白质尽量除干净需多次抽提。3.沉淀 DNA 通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全。沉淀 DNA 也可用异丙醇（一般使用等体积） ，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。 实验二 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳1、原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖是由 -D-吡喃型半乳糖和 3,6-脱水-L-吡喃型半乳糖
11、以糖苷键（1,3-1,4）相互交替链接而成的一种线性半乳多聚糖，能够在热的溶剂中溶化并在冷却过程中形成凝胶。琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片断的典型方法，其特点为简便、快速。在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电场中向正极移动。由于核酸分子结构的重复性，核苷酸数相同的不同核酸几乎具有等量的净电荷，所以在电场中核酸携带的电荷差异几乎不造成核酸迁移率的差异，而真正决定核酸分子在某一特定电场下的电泳迁移率因素，是核酸分子的大小和构象。在适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，通过琼脂糖的分子筛作用，使大小和构象不同的核酸分子泳动距离出
12、现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。在凝胶中加入少量溴化乙锭（EB，有毒！） ，其分子可插入 DNA 的碱基之间，形成一种光络合物，在 254365nm 波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的 DNA 进行检测。电泳时以溴酚蓝作为电泳指示剂。其目的有：增大样品密度，确保 DNA 均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；线状 DNA 片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分浓度（%） 分离线状 DNA 分子的有效范围（kb）0.3 6050.6 2010.7 100.80.9 70.51.2 60.41.5 40.22.0 3
13、0.12、材料、试剂及仪器1. 材料：质粒 DNA 和标准相对分子质量的 DNA Marker2. 试剂：1） TAE 缓冲液（5）：称取 Tris54g，冰醋酸，并加入 0.5M EDTA（pH8.0）20ml，定溶至 1000ml。电泳时 5 倍稀释使用。2）上样缓冲液（6）：0.25%溴酚蓝，30%甘油。 3）溴化乙锭溶液（EB）：5mg/ml 的溴化乙锭，避光保存。4）0.7%琼脂糖，用 1TAE 溶液配制。3. 仪器： 电泳仪、水平电泳槽、微波炉、紫外分析仪等。3、操作步骤1取琼脂糖 0.7g，加入 100ml 1xTAE 电泳缓冲液于 250ml 烧瓶中，加热溶解。将溶液冷却到约
14、5060，加入溴化乙锭到终浓度为0.5ug/ml。2胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子。将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子。将冷却到 5060左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加 1TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止。3 加样: 在点样板或 parafilm 上按 1:1 比例混合 DNA 样品和上样缓冲液, 用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内
15、,为防止污染,每加完一个样品要更换枪头，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压 60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1cm 处时,停止电泳。5. 观察照相: 取出凝胶，在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。注意1. 溴乙啶是一种强致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。2. 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在 0.52之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶 易碎。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的 DNA 带不易分辨，造成条带缺失现象。3. 常用的缓冲液有 TAE 和 TBE，而 TBE 比 TAE 有着更好的缓冲能力。使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使 DNA 电泳产生条带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。实验三 质粒的酶切和鉴定1、原理限制性内切酶是 DNA 操作过程中所使用的一种工具酶，是能识别双链特定 DNA 序列并将其切割的酶的总称。分子克隆中常用的为 II 类限制性内切酶，其识别位点长度为 4
