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1、Lowry法测定蛋白质浓度本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜蛋白质复合物,此复合物加入酚试剂后,产生蓝色化合物,该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,根据供试品的吸光度,计算供试品的蛋白质含量。试剂(1)酚试剂市售酚试剂在使用前用0.5mol/LNaOH滴定液,以酚酞为指示剂,根据试剂酸度将其稀释,使最后酸度为1N。(2)碱性铜溶液取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L硫酸铜溶液(CuSO45H2O)溶液各0.5mL,4碳酸钠(Na2CO3)溶液与0.8% NaOH溶液各25mL,摇匀,即得(注:现用现配)。(3)0.5mol/LNaOH滴定液
2、的配制及标定取NaOH适量,加水搅拌使溶液成饱和溶液,冷却后,置聚乙烯塑料瓶中,静置数日,澄清后,取澄清的NaOH饱和溶液28mL,加新煮沸后冷却的水,使成1000mL,摇匀。取在105干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g,精密称定,加新煮过的冷水50mL,摇匀,使其尽量溶解;加酚酞指示剂2滴,用本液滴定;在接近终点时,应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解,滴定至溶液显粉红色。每1mLNaOH滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量,算出本液的浓度。(4)标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品1支,用水定量稀释至每1mL含1mg,作为贮备液。精密量取贮备液2.
3、5mL至25mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,即为每1mL含100g的标准蛋白质溶液。测定方法精密量取一定体积供试品(含蛋白质50g左右)置试管内,加水至1mL,加碱性铜溶液5mL,摇匀,室温放置10min,快速加入酚试剂0.5mL,摇匀,室温放置30min,显色后,照紫外可见光光度法,在波长650nm处测定吸光度(显色后,如发现混浊,3000r/min,离心15min,取上清液测定)。精密量取标准蛋白质溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL分别置于试管中,加水至1mL,加碱性铜溶液5mL,摇匀,室温放置10min,快速加入酚试剂0.5mL,摇匀,室温放置30min,显色后,照紫外可见光光度法,在波长650nm处测定吸光度(显色后,如发现混浊,3000r/min,离心15min,取上清液测定)。准确量取1mL水作空白对照,具体操作方法同上。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度,取直线回归方程,将测定供试品的吸光度代人直线回归方程,即得供试品的蛋白质含量。