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1、第十九章生物技术药物制剂 湖北医药学院药剂教研室李铮铮 第一节绪论 生物医药产业的发展经历了三个不同的历史阶段 即天然药物阶段化学合成药物阶段基因工程药物阶段 生物技术 是指对有机体的操作技术 包括利用活的有机体来生产或修饰获得产品的所有技术 现代生物技术包括 基因工程 细胞工程 发酵工程和酶工程 其中核心技术是基因工程技术 生物技术药物 是采用现代生物技术人为地创造条件 借助生物体 微生物 动物和植物等 或其组成部分 器官 组织 细胞 酶等 来产生所需要的医药产品 生物技术药物的经典定义 是指利用重组DNA技术获得的蛋白质多肽类药物 人胰岛素的一级结构 胰岛素的两个肽链分别为21个氨基酸组成
2、的A链和30个氨基酸组成的B链 氨基酸排列有种属差异 1982年美国Lily公司开发世界上第一个基因工程 重组人胰岛素 先确对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质 然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来 经过一系列基因操作 最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去 包括细菌 酵母菌 动物或动物细胞 植物或植物细胞 在受体细胞中不断繁殖 大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质 最近又研究了以酵母菌为宿主细胞进行合成人胰岛素 可参考文献 人类胰岛素基因的克隆及其真核表达载体的构建 产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建 一 生物技术药物 生物技术药物或生物制品是一个更广义的概念除了经典的生物药物如蛋白质
3、多肽 抗体 DNA RNA和寡核苷酸等外 还包括疫苗 组织 血液 血液制品以及由天然来源提取的细胞疗法等 一 生物技术药物 全球药物销售统计数据显示 2012年全球销售居前20名的药物中有8个生物药物 而其中7个生物药物列于销量前10名的名单中 一 生物技术药物 1 与小分子药物相比 生物药物的药效及特异性更强 且副作用较小 原因 很多生物药物都具有独特的空间构象 而且通常它们都是内源性物质 它们在体内与特定受体结合 这种结合具有很强的专一性 一 生物技术药物 2 目前小分子药物的研究已经进入了瓶颈期 生物药物可能会为某些疾病的患者提供一线生机 二 生物药物开发的近况及挑战 1 生物药物分子体
4、积一般比较大 具有亲水性和解离特性 导致其膜通透性极差 大部分生物药物必须采用注射方式给药以保证足够的生物利用度 由于其血浆半衰期短 通常需要采取一日多次注射的给药方案 二 生物药物开发的近况及挑战 2 大多数生物药物的物理和化学性质不稳定 因此在处方设计时需要考虑很多策略改善其制剂处方 以提高生物药物在制备 贮存 运输以及给药时的稳定性 确保它们的有效性和安全性 二 生物药物开发的近况及挑战 例如 蛋白质药物 集聚 激发机体 免疫应答 机体分泌抗体清除该蛋白药物 改变该蛋白药物的药物动力学行为 产生副作用 二 生物药物开发的近况及挑战 3 与小分子药物制剂相比 生物药物制剂的研发过程中需要依
5、靠更多不同的分析手段表征生物药物的特征 例如 对乙酰氨基酚与阿达木单抗 P353 二 生物药物开发的近况及挑战 4 对于核酸类药物如反义寡核苷酸 小干扰RNA和基因等作用靶点位于细胞内的生物药物 普通的液体注射剂已经不能满足其递送要求 很难通过富含脂质的细胞膜到达其胞内靶点 研发核心 能高效帮助核酸跨越生物屏障的递送系统 生物技术药物的经典定义 是指利用重组DNA技术获得的蛋白质多肽类药物 蛋白和多肽类药物分子之间的区别 描述蛋白质的构象结构 第二节蛋白多肽类药物制剂 一 蛋白多肽类药物的生产蛋白类药物通常是利用哺乳动物细胞 中国地鼠卵巢细胞系 以及细菌 如大肠杆菌 或酵母细胞来进行制备 蛋白
6、质产率是评价这一过程的效率的重要指标 二 蛋白多肽类药物的结构与理化性质 多肽分子量质量 5KD 由大约少于50个氨基酸所组成的肽链为多肽 蛋白质分子量质量 5KD 具有三维机构的大分子称为蛋白质 二 蛋白多肽类药物的结构与理化性质 大部分蛋白质都具有三维结构蛋白质天然折叠形成的结构称为其天然构象 蛋白质分子构象分为四级 一级结构是指氨基酸残基按照特定顺序通过肽键连接形成的长链 蛋白质二级结构 氨基酸长链通过规律性重复出现的局部结构折叠形成二级结构 蛋白质高级结构 氢键或二硫键进一步相互交联形成的链折叠称为三级机构 它是控制蛋白质基本功能的结构 疏水作用和离子相互作用等弱相互作用力通常对三级机
7、构起到稳定化作用 蛋白质多肽类药物的活性与其机构的完整性密切相关 为什么蛋白类药物需要在制剂中保持正确的折叠构象 维持蛋白质构象结构稳定性的作用力包括哪些 三 蛋白多肽类药物的稳定性 蛋白质多肽类药物 其生物活性的保持不仅取决于它的化学稳定性 还取决于其物理稳定性 即其空间构象的稳定性 化学不稳定性表现为新化学键的形成或原化学键的断裂导致其一级机构的变化 变化过程包括蛋白质或多肽的水解 脱酰胺 氧化 外消旋 二硫键断裂等 物理不稳定性即其化学组成 一级结构 不变 而高级结构 二级及二级以上结构 发生改变的过程 物理不稳定性包括变性 去折叠 聚集 沉淀和表面或界面吸附等 三 蛋白多肽类药物的稳定
8、性 一 化学不稳定性1 脱酰胺反应 P355 Glu谷氨酰胺Asp天冬酰胺侧链上的酰胺基被水解 形成游离羧酸根 攻击肽键 形成丁二酰亚胺中间体 进一步水解成天冬氨酸或者异天冬氨酸 天冬氨酸的氨基侧链被羧基取代 故被称为脱酰胺基作用 三 蛋白多肽类药物的稳定性 一 化学不稳定性2 氧化反应蛋白质多肽氨基酸链中甲硫氨酸 半胱氨酸 组氨酸 色氨酸 和酪氨酸的侧链都是可能发生氧化反应的位点 引发氧化反应的因素除了空气中的氧 还包括离子 自由基 光照等 三 蛋白多肽类药物的稳定性 一 化学不稳定性3 二硫键断裂或交换巯基 二硫键和它们之间的相互作用对大部分蛋白的性质都具有重要影响 4 其他水解 外消旋
9、异构化等 常见 但选择适当的条件来阻滞或避免 三 蛋白多肽类药物的稳定性 二 物理不稳定性1 变性 去折叠 蛋白质内部的疏水残基相互作用决定2 聚集 部分变性的蛋白质分子间结合形成的3 表面 界面吸附 活性蛋白质或部分去折叠的蛋白质在表面上的吸附 在界面上重新定位和排布4 沉淀 肉眼可见的蛋白质从溶液镇南关析出的过程 这种行为不可逆的 颗粒形成 二 物理不稳定性 1 变性 去折叠蛋白质的物理稳定通常是有蛋白质内部的疏水残基间相互作用决定的 当这些疏水残基暴露在溶剂中时 它们会与疏水性界面相互作用 或者引起这些失活的蛋白质在局部富集 从而导致蛋白聚集及沉淀 二 物理不稳定性 2 聚集蛋白质聚集是
10、由部分变性的蛋白质分子间结合形成的 变性剂 十二烷基硫酸钠 盐酸胍和尿素可以用来确定蛋白质聚集是否为共价聚集非共价聚集 蛋白质聚集物可以在变性剂中溶解 反之则为共价 化学 聚集 二 物理不稳定性 3 表面 界面吸附表面 界面诱发的蛋白质不稳定性过程始于蛋白质或部分去折叠的蛋白质在表面上的吸附 随后吸附的蛋白质分子在界面 气 液界面或固 液界面 上重新定位和排布 二 物理不稳定性 4 沉淀蛋白质聚集主要可溶性聚集物 而沉淀指的是肉眼可见的蛋白质从溶液中析出的过程 不可逆的这种情况叫做 颗粒形成 胰岛素结霜就是一个发生蛋白质沉淀的典型例子 指的是胰岛素在容器壁上形成了细小的沉淀颗粒 三 蛋白多肽类
11、药物的稳定性 三 影响蛋白多肽类药物分子稳定性的因素 P357 温度 pH 表面界面作用 盐类 金属离子 螯合剂 摇晃剪切力 非水溶剂 蛋白质浓度 蛋白质纯度 三 蛋白多肽类药物的稳定性 四 蛋白多肽类药物稳定性的分析方法监测蛋白质和多肽药物的不稳定性是开发蛋白质多肽类药物制剂过程中的主要工作之一 列举一些用于稳定蛋白多肽类药物分子的药用辅料 并简述这些辅料的稳定化机制 四 蛋白多肽类药物制剂及其稳定化方法 一 蛋白多肽类药物制剂的稳定化方法1 替换容易发生降解的氨基酸 2 加入稳定剂改变蛋白质的外在环境 3 通过干燥手段固化蛋白质 减少其降解概率 四 蛋白多肽类药物制剂及其稳定化方法 常用的
12、稳定剂缓冲液 磷酸盐缓冲液 枸橼酸盐缓冲液糖类及多元醇 蔗糖 海藻糖 葡萄糖表面活性剂 聚山梨醇酯类 普朗尼克盐类 NaCl Kcl聚合物 血清白蛋白 聚乙二醇 羟丙基 CD金属离子 Ca2 Mg2 Zn2 氨基酸 组氨酸 甘氨酸 甲硫氨酸抗氧剂 维生素C 硫磺盐 枸橼酸 四 蛋白多肽类药物制剂及其稳定化方法 蛋白质的干燥冷冻干燥过程中可能使蛋白质变性的因素及其变性机制1 低温2 浓度效应3 冰 水界面的形成4 冷冻过程中的pH变化5 冷冻过程中的聚合物相分离6 脱水化作用 低温保护剂 海藻糖 蔗糖 麦芽糖等糖和多元醇 羟丙基甲基纤维素 白蛋白等聚合物冻干保护剂 海藻糖 蔗糖 麦芽糖等糖和多元
13、醇类 白蛋白 右旋糖酐等聚集物 四 蛋白多肽类药物制剂及其稳定化方法 二 蛋白质和多肽类药物制剂开发过程简介1 建立分析方法表征蛋白质和多肽药物分子的物理化学性质2 确定目标生物药物的产品特征3 制剂稳定性试验 五 蛋白质和多肽类药物的递送 注射剂通过延长蛋白质和多肽类药物的血浆半衰期或溶出度 从而降低注射频率制剂手段 化学修饰 PEG化 糖基化 乙酰化 氨基酸替换 蛋白融合贮库给药系统 微粒递药系统 原位贮库递药系统 植入递药系统蛋白质结晶或沉淀 五 蛋白质和多肽类药物的递送 非注射型运用非注射的其他给药途径制剂手段口服递药肺部递药透皮递药鼻腔递药口腔递药 第三节寡核苷酸及基因类药物制剂 一
14、 寡核苷酸及基因类药物的结构和性质化学组成均为聚核苷酸结构 其中DNA分子为脱氧核苷酸的聚合物 RNA分子为核苷酸的聚合物 分子量大 带有大量的负电荷 水溶性好 几乎没有脂溶性 作用靶点都是在细胞内 药物递送必须跨越细胞膜和核膜的壁垒 必须借助基因递送载体 二 寡核苷酸及基因类药物的递送载体设计 目前基因治疗领域主要有三类不同的药物递送技术体系 1 物理转染技术2 病毒载体系统3 非病毒载体系统 一 非病毒载体的构建和表征 由于DNA RNA分子等带有大量的负电荷 所以能够与带正电的载体材料相互复合 形成电荷相互作用复合物脂质复合物 阳离子脂质体与DNA形成的复合物聚阳离子复合物 阳离子聚合物与DNA形成的复合物 二 非病毒载体的体内送过程 静脉注射给药 重视子载体在递送过程中的稳定性载体分子表面上涌PEG修饰将基因药物导入特定的靶细胞中 三 细胞传染和基因药物的释放 阳离子脂质载体阳离子聚合物 疫苗制剂 减毒活性病原体疫苗 传统疫苗 模拟病原体对机体的感染过程 有效 失活疫苗 炎症反应少 安全性高亚单位疫苗 炎症反应更少少 致病性组分保存在失活疫苗中 谢谢
