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1、色谱柱的故障诊断与维护 液相色谱柱 八方世纪科技有限公司北京总部 010 82656628 82656500 82656399广州办事处 020 87768360 87786522 AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice ifrequired H LC与GC色谱柱问题用户调查 色谱柱问题 百分率 BackPressure PluggedFrits 24 PoorReproducibility 16 SampleRecovery 14 LossofResolution 13 Instability 11 Voids 8 1 Leaks Fittin
2、gs 4 8 pHRange 2 0 LowPlateCount 2 0 ColumnOverload 2 0 Cost 1 7 Miscellaneous 15 介绍提纲 I 常见问题 现象及排除方案 基线漂移 噪音 峰型 压力变化 保留漂移II 日常维护 良好的实践 在线装置 样品制备 操作的限制 III 再生 维修已损坏的色谱柱 物理方法 化学方法 I 常见问题基线噪音 可能的原因 流动池脏 检测器灯有问题 如果是周期性的 则起源于泵的脉冲 温度对检测器的影响 气泡经过检测器 基线漂移 梯度洗脱 温度不稳定 示差检测器 流动相中有污染物 柱中的流动相没有平衡 体系中有污染物流出 可能的原
3、因 鬼峰 鬼峰 即使不样也会出现的峰 20 100 MeOH 没有进样 3 7 15 17 问题1 流动相脏问题2 样品过量 也可能是回收率太差 峰型 双峰 柱塌陷 柱中有死体积 过滤片部分堵塞 只有一个双峰 组分的共洗脱 可能原因 样品与溶剂不匹配 峰型 所有的峰都展宽 柱效降低 柱死体积 大进样量 质量 高捻度流动相 部分峰展宽 前次进样后流出的组分 大分子量样品 蛋白或聚合物 样品与流动相不匹配 峰型 原因 部分峰拖尾 二次保留效应 残留硅醇基的反应 小峰紧跟在大峰的后面流出 柱头有污染 金属 所有峰拖尾 额外的柱效应 柱损坏 不适当的样品量 溶剂 峰型 峰型 负峰 正常峰 负峰 原因样
4、品的吸收比流动相的吸收值低当样品组分通过色谱柱时打破了原来的平衡用示差检测器时是正常的 宽峰 柱外体积增加 在进样口到柱或柱到检测器之间 使用细的短的连接管 保证所有的管路接头都使用正确 用小体积检测池 减少进样量 柱外体积 MinimizeLengthandDiameterofTubing DoNotVolumeOverloadInjection UseAppropriateVolumeFlowCell E C V Vinj Vtubing Vcell HPLC使用的接头 无死体积接头 不适用的接头 HPLC中使用的柱接头 0 090in 0 130in 0 090in 0 170in Sw
5、agelok Waters Parker Rheodyne Valco Uptight 0 090in 0 080in TroubleshootingLCFittings PartII J W DolanandP Upchurch LC GCMagazine6 788 1988 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 柱外体积 10 L 20 L Time min 2 1x150mm F 0 2mL min 柱外体积效应的影响 1ul进样 I 不进样时柱压连续升高 泵密封垫 流动相有颗粒 流动相溶解性 流动相的不稳定性 聚合 形成柱死体积 与使用条件有关 II 进样时压力升高 样品有
6、颗粒 样品在流动相中不溶 样品组分与固定相不兼容 压力 I 所有峰都向低保留值方向漂移 酸 碱 中性化合物 键合相流失 流动相不稳定 可能性较小 溶剂输送系统 流速变化 II 所有峰都向高保留值方向漂移 在水 有机溶剂的混合体系中 有机溶剂含量减少 柱改变 可能性较小 溶剂输送系统 流速变化 III 离子型化合物的色谱峰的保留值漂移 流动相中挥发性组分损失 离子强度 pH漂移 柱改变 键合相或污染 保留值漂移 I 与流动相有关的问题 使用新鲜的流动相 pH 电导 色谱性能测试II 与色谱柱有关的问题 测试新柱 用标准的测试混合样测试新柱 清洗 色谱柱后再测 考虑样品基质与使用条件对柱稳定性的影
7、响 保留值漂移 良好的柱使用规范 预柱与保护柱 从泵来的流动相 预柱 进样器 保护柱 分析柱 到检测器 预柱对流动相而言 保护柱对色谱柱而言 StrippingorConcentratingColumn AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice ifrequired H 带可重复使用接头及完整保护柱的卡套柱 无保护柱 有保护柱 带Techtron保护柱的Zorbax卡套柱 min 5 10 15 20 25 30 35 mAU 140 142 5 145 147 5 150 152 5 155 157 5 160 min 5 10 15 20 25
8、 30 35 mAU 140 142 5 145 147 5 150 152 5 155 157 5 160 BDSODSHypersil250 2mm有integratedGuardColumn BDSODSHypersil250 2mm没有GuardColumn 2mmID卡套柱有或无保护柱的比较 制备样品 流动相 过滤样品 以确保其不含有固体微粒 用流动相或比流动相极性较弱的溶剂溶解样品 进样的样品体积应尽量小 样品不溶于流动相 真正的环境样品样品的溶解性溶剂强度体积效应Contaminant微粒强保留的组分 样品制备方法的进步 1 固相萃取 SPE 硅胶基键合相品种全 可多次使用的聚合
9、物 唯一的选择性 自动化工艺 玻璃 Teflon基体适合高灵敏度的工作 专业化 滥用药物 儿茶酚胺 脱盐 去金属 3 带不同功能团的过滤膜 4 SPE薄膜 2 屏蔽亲水相 内部多孔载体 操作条件 流动相对柱寿命的影响 易水解的硅氧键 操作条件 流动相对色谱柱寿命的影响 键合相水解速度随温度的升高而加大 StableBondCN diisopropylpropylCN ConventionalCN dimethylpropylCN LowpHeluentatelevatedtemperature 60C 在安装柱前后测试压力差如果柱压力太高 反装色谱柱 并用10 20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱
10、监测压力变化若出现沉淀 如 蛋白凝聚 细胞物 聚合物 设法用相应的可溶性溶剂 如0 1 TFA 80 乙腈 6M盐酸胍 THF HFIP若仍无效 应考虑更换过滤片 色谱柱的修复与再生 物理性阻塞 ColumnInletFrit CompressionFerrule ColumnBody FemaleEndFitting MaleEndFitting 带手套填料不能变干不要接触色谱柱体加热填料会被挤出不要拧的过紧 色谱柱故障诊断 更换进样口过滤片 由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是不可逆的由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复梯度洗脱的方式 水 强有机溶剂 通常
11、最有效低pH流动相 如0 1 TFAor0 01MH3PO4 也是有效的升高温度 60 80 色谱柱修复和再生 化学变化 I 6M盐酸胍 异硫氰酸胍 尿素等溶液可用于清除蛋白质的沉积XDB 有机聚合物等填料可使用高pH水溶液 有机溶液 如 0 01MNaOH50 异丙醇 水溶液 硅胶基质应尽量减少接触时间 15 30min 色谱柱的修复和再生 化学变化 II Example 4 6mmIDx15cmZorbax300SB C18Flowrate 1mL min Temp 80 A 0 1 TFAinwaterB 0 1 TFAinacetonitrile100 Afor30min 0 100 Bover30min Hold100 Bfor30min Returnto100 Ain5min Repeat3times 总结 如果使用时加以注意 大部分的液相色谱柱的问题是可以预防的 流动相必须是互溶的 无颗粒 使用保护柱和在线过滤器 并定期更换 使用恰当的样品制备方法 使用恰当的色谱柱清洗程序 不同类型的色谱柱 请选择不同的操作条件 如 SB pH1 6 XDB pH3 11 保存柱反压及重要的色谱参数的记录 如 R N As k 色谱柱需保存在有机溶剂中 乙腈
