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1、表皮生长因子体外定向进化及对其结构与功能之间关系的研究 中山大学硕士学位论文表皮生长因子体外定向进化及对其结构与功能之间关系的研究姓名： 专业：生物化学与分子生物学导师： 副教授中山大学生命科学院，广州，510275 年10月A Dissertation Submitted toSun Yat-sen Universityforthe Degree of Master of ScienceIn vitro directed evolution of epidermal growth factor and a study about the relationship between its st
2、ructure and functionCandidate Qianqian WangSupervisor Associate Prof. Qing ZhangMajored Biochemistry and Molecular BiologySchool of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou, 510275, China Oct, 2009- 96 -目录目录I摘要IIIAbstractV第一章 文献综述- 1 -1.1 表皮生长因子及其家族- 1 -1.1.1表皮生长因子理化性质- 1 -1.1.2 EGF的生理功能及应用-
3、 3 -1.1.3 EGF生理功能的作用机制- 4 -1.1.4 EGF家族成员及其结构与功能特性- 7 -1.2 EGF受体（EGFR）的生理特性及其研究进展- 7 -1.2.1 EGFR的生理特性及信号传导途径- 7 -1.2.2 EGFR在癌症发生、发展及治疗中作用的研究现状- 9 -1.3 本研究的方法与技术- 12 -1.3.1 本研究的技术路线- 12 -1.3.2 定向进化技术及本研究采用的改组策略- 12 -1.3.3 噬菌体展示高通量筛选技术- 16 -1.3.4 圆二色谱技术在生物学领域的应用- 18 -第二章 EGF定向突变文库的构建- 22 -2.1 材料与方法- 22
4、 -2.1.1 实验材料- 22 -2.1.2 方法- 24 -2.2 结果与分析- 28 -2.2.1 易错PCR诱变hEGF与pEGF- 28 -2.2.2 StEP重组文库的建立- 30 -2.3 讨论- 31 -2.3.1 进化亲本的选择- 31 -2.3.2 易错PCR条件的优化- 32 -2.3.3 StEP条件的选择- 33 -2.4 小结- 34 -第三章 突变文库的亲和性筛选及阳性克隆的表达、纯化及活性检测- 35 -3.1 材料与方法- 35 -3.1.1实验材料- 35 -3.1.2 方法- 38 -3.2 结果与分析- 43 -3.2.1 噬菌体表面展示文库的建立- 4
5、3 -3.2.2 噬菌体展示文库的淘洗筛选- 44 -3.2.2 细胞ELISA筛选淘洗后文库- 44 -3.3 讨论- 45 -3.3.1 细胞表面噬菌体展示文库的筛选- 45 -3.3.2 ELISA方法的选择- 47 -3.4 小结- 48 -第四章 噬菌体展示阳性克隆的表达与活性检测- 49 -4.1 材料与方法- 49 -4.1.1实验材料- 49 -4.1.2 方法- 51 -4.2 结果与分析- 56 -4.2.1 阳性克隆表达载体的构建- 56 -4.2.2 重组EGF的表达及纯化- 57 -4.2.3 MTT分析重组蛋白活性- 58 -4.2.4 重组子序列的测定分析- 58
6、 -4.2.5 EGF E40V表达条件的优化- 59 -4.2.6 优化条件下的表达规模扩增- 60 -4.2.7 纯化蛋白的透析与蛋白浓度的测定- 63 -4.3 讨论- 64 -4.3.1 大肠杆菌融合性表达重组EGF- 64 -4.3.2 原核表达蛋白的纯化- 66 -4.3.3 MTT实验条件的调整- 68 -4.3.4 重组EGF序列突变位点的分析- 69 -4.4 小结- 69 -第五章 EGF Y13G突变体的获得、EGF的pET28a重组表达与样品的圆二色谱分析- 71 -5.1 材料与方法- 71 -5.1.1 材料- 71 -5.1.2 方法- 72 -5.2 结果与分析
7、- 75 -5.2.1 pET28a-EGF重组表达条件的优化- 75 -5.2.2 纯化蛋白样品的圆二色谱测定分析- 78 -5.3 讨论- 79 -5.3.1 pET28a重组表达EGF- 79 -5.3.2 圆二色谱检测EGF二级结构- 80 -5.4 小结- 81 -第六章 总结与展望- 82 -6.1 总结- 82 -6.2 展望- 82 -缩略词表- 84 -参考文献- 86 -致 谢- 93 -表皮生长因子体外定向进化及对其结构与功能之间关系的研究生物化学与分子生物学硕士研究生 副教授摘要人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)发现于
8、1962 年，是一种由53 个氨基酸残基组成的单体多肽。已证实hEGF 是一种关键性的创伤愈合因子，通过与其受体的结合，它能对上皮细胞和间质细胞产生很强的致分裂作用；能促进皮肤、角膜、肺和气管上皮组织等的增殖和分化；对表皮损伤和溃疡具有卓越修复功能；临床上对肠、胃、肝等器官表面损伤的修复和再生也有显著疗效。总之，hEGF在医疗、美容护肤等方面有着广泛的应用前景。但是由于其自身半衰期较短等不利因素，至今尚未得到广泛的使用，利用分子手段将它进行改造已成为必然。针对EGF的三维结构已比较清楚但结构和功能之间的关系并不清楚而且EGF分子本身很小不利于改组的情况，本研究采用易错PCR和StEP联合的方法
9、将hEGF和pEGF的DNA进行分子定向进化。通过多次尝试，探索了简便、有效、优化的EGF体外定向进化的技术路线，构建了定向进化文库，用SSCP初步检测文库突变率可以达到其它大分子改组的水平。然后将突变文库构建成噬菌体展示文库，通过活细胞噬菌体展示、ELISA和MTT的方法筛选到活性增强的突变体EGF26，为EGF体外定向进化提供可借鉴经验。通过测序我们发现了其突变为40GluVal，为了解这一突变引起的二级结构变化，对EGF26和hEGF进行了圆二色谱的检测，并分析了这些变化对EGF活性增强的贡献，为了解EGF结构与功能之间联系打开新的视角。此外，本研究构建了pET32a(+)-EGF26
10、重组质粒，以本实验室构建保存的pET32a(+)-hEGF为对照，用BL21为宿主菌进行融合表达。通过表达条件的优化最终确定在37，菌液初始OD600=0.5，IPTG 0.5mmol/L，诱导时间6 小时的条件下EGF得到最高的溶解性表达，而且使用金属螯合亲和层析纯化后结果表明，EGF26的溶解性表达优于hEGF，为EGF26的最终应用打下基础。关键词：表皮生长因子 定向进化 噬菌体展示 CD谱 溶解性表达 二级结构In vitro directed evolution of epidermal growth factor and a study about the relationship
11、 between its structure and functionBiochemistry and Molecular BiologyMaster Wang Qianqian Zhang Qing associate professorAbstractHuman epidermal growth factor (hEGF) as the first cell factor which was found in 1962 is a polypeptide with 53 amino acid residues. HEGF has been confirmed a key factor in
12、wound healing. And it makes a strong role in epithelial cells and stromal cells differentiation, and also promotes the proliferation and differentiation of the skin, cornea, lung and tracheal epithelial tissue. Further more, it was proved excellent clinical utility in skin injury and ulcer repair, i
13、ntestines, stomach, liver and other organs to repair surface damage and regeneration. In a word, it has a significant effect in the medical and beauty care, etc. But there are many unfavorable factors keep hEGF from widely using, such as a shorter half-life etc. Then the evolution of wild hEGF is ne
14、cessary. The conditions the tertiary structure of EGF has been learned clearly but the relationship between the structure and function of the EGF is not clear and a small molecule itself is not conducive to the recombination with traditional shuffling. So a methodcombination of error-prone PCR and S
15、tEPwas adopted in this study to recombine the DNA of hEGF and pEGF. Through several tests a simple, effective, and optimized directed evolution of EGF in vitro technique was found, and a directed evolution library was constructed. The mutation rate of library was initially detected by SSCP, and the result showed it has achieved almost the same rate in other bigger molecules evolution. T
