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1、 中国科学技术大学硕士学位论文B23通过抑制Eg5 ATP酶活性抑制Eg5对微管的解聚 作者姓名： 学科专业： 细胞生物学导师姓名： 教授完成时间： 二一年五月八日University of Science and Technology of ChinaA dissertation for masters degree B23 inhibits Eg5-mediated microtubules depolymerization via inactivating its ATPase activityAuthors Name： Wang Guoxingspeciality： Cellular
2、BiologySupervisor： Prof. Wu Mian Finished time: May 8th, 2010B23通过抑制Eg5 ATP酶活性抑制Eg5对微管的解聚八系 中国科学技术 大学Abstract摘 要核仁磷酸蛋白B23是肿瘤细胞核仁中含量丰富的磷酸蛋白质，对细胞增殖和生长起着多重重要的调控作用。由于基因剪切方式不同产生两种蛋白质亚型，亚型1，即通常情况下所说的B23，全长有294个氨基酸，比亚型2的C端多35个氨基酸。B23的C端DNA和RNA结合结构域（DRBD）易发生突变，其突变能够诱发急性髓性白血病AML。AML的发生是因为B23的突变体引起了B23在细胞质中的异
3、常大规模聚集。虽然B23在细胞核内的功能被广泛研究并报道，但是B23在细胞质行使何种功能还没有具体报道。因此，B23突变体诱导AML的具体机制目前仍不清楚。有鉴于此，我们试图了解B23在细胞中存在的意义。首先，我们在试图研究B23在细胞质可能存在的新功能时，我们采用酵母双杂交系统筛选并鉴定了一个B23的新的结合分子，Kinesin家族成员Eg5，并进一步证实了B23与Eg5的相互作用发生在细胞质中。这对我们探索B23在细胞质的功能提供了线索。其次，我们在对B23与Eg5结合的意义进行研究时，我们惊喜地发现B23能够调控微管聚集状态，并且这种调控作用与Eg5对微管的调控是截然相反的：Eg5能够促
4、进微管解聚；而B23则保护微管防止微管解聚。这进一步对了解B23在细胞质的功能提供机会。再次，我们在研究B23调控微管的作用机制时，我们发现B23通过直接抑制Eg5的Motor活性，即ATPase酶活，实现了调控微管的功能。这完整地提供了一个B23在细胞质中的新功能以及行使功能的机制，为我们进一步了解B23提供新的平台。同时，由于Eg5是细胞内最重要的肿瘤治疗靶点，所以，对B23尤其是其C端DRBD结构域的进一步研究，可为药物开发提供潜在的靶点，从而提供新的肿瘤治疗方案。总而言之，我们的工作为了解B23在正常肿瘤细胞的细胞质中存在的意义和其在细胞质在的功能做出了自己的发现。关键词：核仁磷酸蛋白
5、B23，Eg5，肿瘤治疗，微管动力学，ABSTRACTNucleophosmin/B23, an abundant nucleolar protein, plays multiple roles in cell growth and proliferation. There are two B23 isoforms. Subtype 1, which is the full length of B23, is 35 amino acids longer than Subtype 2. C-terminus of B23 ,which is called DNA and RNA Binding
6、Domain （DRBD）, is tend to mutanted., and its mutations could induce Acute myeloid leukemia (AML). It is reported that B23 mutations lead to aberrant localization of the B23 protein into the cytoplasm and promote AML occurrence. Despite its functions inside the nucleus is well-studied, functions of B
7、23 in the cytoplasm remains elusive. Therefore, it is unclear exactly that how B23 mutations lead to AML. We then tried to find the meaning of B23 locates in the cytosol.Firstly, a Yeast-Two-hybrid system was used to screen B23 novel interact partners. And a member of the kinesin family, Eg5, was fo
8、und and identified to interact with B23. It is further proved that B23 directly interacts with Eg5 in the cytosol. This evidences give some indications about the function of B23 in cytoplasm.An interesting result was then found that in opposite to Eg5, B23 promotes microtubule (MT) polymerization. T
9、his was the first evidence that B23 plays an important role in regulating MT dynamics in cytoplasm.Further results showed that B23 regulates MT dynamics by directly inhibiting Eg5 ATPase activity. It makes senses for studying novel B23 functions. Furthermore, as Eg5 is an important anti-neoplasmic d
10、rug target, and wild type B23 could inhibit AML development, whether the inhibitors of Eg5 such as mimics of DRBD of B23 could be used in treating AML patients is of clinical interest.In a word, our works suggest that B23 has an important function in cytoplasm.Keywords: B23, Eg5, cancer clinical tre
11、atment, microtubule dynamicII目 录目 录第1章 绪论11.1 B23蛋白和细胞命运调控11.1.1 B23简介11.1.2 B23的结构分析21.1.3 B23的功能分析21.2 Eg5蛋白与细胞周期调控61.2.1 Eg5简介61.2.2 Eg5的功能及在肿瘤治疗中的作用101.3酵母双杂交系统和ATP酶的耦合分析系统111.3.1 酵母双杂交系统111.3.2 ATP酶的耦合分析系统12第2章 实验结果及讨论132.1 结果132.1.1 Eg5被筛选并鉴定为与B23发生相互作用的新分子132.1.2 B23与Eg5发生相互作用172.1.3 B23通过其DR
12、BD结构域与Eg5的动力结构域发生相互作用192.1.4 与Eg5相反，B23抑制微管解聚，促进微管聚集212.1.5 B23抑制微管解聚的功能是通过直接抑制Eg5的ATP酶活实现的252.1讨论与分析30第3章 实验材料与方法343. 1 实验材料343.1.1 细胞系及培养液343.1.2 大肠杆菌菌株及酵母株343.1.3 酵母双杂交系统343.1.4 表达载体343.1.5 主要试剂、抗体以及试剂盒343.1.6 其它343. 1 实验方法343.2.1 Total RNA的提取353.2.2 RT-PCR363.2.3 琼脂糖凝胶电泳363.2.4 回收DNA 片段373.2.5 PCR 373.2.6 酶切383.2.7 连接383.2.8 制备大肠杆菌感受态细胞393.2.9 转化393.2.10 抽提质粒检测构建状况393.2.11 酵母小规模转化403.2.12提取酵母蛋白413.2.13 SDS-PAGE 电泳413.2.14 Western Blotting423.2.15 酵母自激活的检测433.2.16大规模转化433.2.17 液氮变蓝实验
