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1、 密级： 保密一年 NANCHANG UNIVERSITY 学 士 学 位 论 文THESIS OF BACHELOR（2007 2011 年）题 目 草鱼PKZ Z基因的克隆及表达纯化学 院：生命科学与食品工程学院 系 生物系 专业班级： 生物工程072班 学生姓名： XXX 学号： XXXX 指导教师： XXX 职称： XX 起讫日期： - 16 -南 昌 大 学学士学位论文原创性申明本人郑重申明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文
2、中以明确方式表明。本人完全意识到本申明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期：学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于 不保密。（请在以上相应方框内打“”）作者签名： 日期：导师签名： 日期：摘要草鱼PKZ Z基因的克隆及表达纯化专 业：生物工程 学 号：5602207053学生姓名：胡乐华 指导教师：范丽
3、华摘要PKR是由干扰素诱导产生的、依赖双链RNA(dsRNA)激活的蛋白激酶，鲫鱼类PKR蛋白是第一个报道的非哺乳类PKR同源物，其鱼类干扰素系统中含Z-DNA结合域故称为PKZ。为了得到草鱼PKZ Za基因及PKZ，由于草鱼CiPKZ基因序列与鲫鱼CaPKZ的基因序列具有极高的同源性，本文根据已知的鲫鱼CaPKZ全长cDNA序列，设计引物，经过PCR得到了草鱼PKZ基因，在将目的基因连接到pET-32a载体，导入大肠杆菌，原核表达、纯化后得到PKZ。由于在酸性条件下，考马斯亮蓝G-250和蛋白质结合产生特殊的蓝色，最大吸收波长在595 nm处。最后通过考马斯亮蓝法测定该蛋白质的浓度为0.97
4、mg/ml。关键词：PKZ； 鱼类干扰素； 引物设计；PCR；草鱼；原核表达；考马斯亮法；ZaAbstractAbstractPKR is an dsRNA-dependent protein kinase that is induced by interferon treatment.A fish PKR-like gene,named CaPKR-like,was the first identified fish gene most similar to mammalian PKRs. The interferon system of fish containing Z-DNA bind
5、ing domain is known as the PKZ. Because the sequence of grass carp CiPKZ gene and the gene sequence of crucian carp CaPKZ gene is highly homologous. According to the known full-length cDNA sequences of carp CaPKZ. Primers, After PCR, the grass carp PKZ genes, In the target gene connected to the pET-
6、32a vector, Into E. Coli, Expression, purification by PKZ.As the acidic conditions, Bradford G-250 and protein combine to produce a special blue, The maximum absorption wavelength at 595 nm, Finally, the Bradford method of protein concentration of 0.97mg/ml.Keywords:PKZ; Fish interferon; Primer desi
7、gn; PCR; Grass carp; Prokaryotic expression; Bradford; Za目录目录摘要Abstract第一章 文献综述11 .1 PKZ简介11. 2 PKZ的结构特征41. 3 PKZ的激活机制121. 4 Za131. 5草鱼简介191. 6 PCR221. 7 IPTG的诱导作用241. 8本论文的研究目的和意义24第二章 材料和方法31 2. 1 实验材料312.1.1 主要仪器和设备242.1.2 主要试剂242.1.3 实验材料242. 2实验方法322.2.1草鱼PKZZcDNA的克隆242.2.1 原核表达PKZZ第三章 实验结果31结论
8、136参考文献（References）138致谢150第一章 文献综述第一章 文献综述1.1 PKZ简介PKR是由干扰素诱导产生的、依赖双链RNA(dsRNA)激活的蛋白激酶，属丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶超家族和eIF-2激酶家族，在哺乳动物细胞中广泛存在。鲫鱼类PKR蛋白是第一个报道的非哺乳类PKR同源物，其鱼类干扰素系统中含Z-DNA结合域故称为PKZ，经过与其他哺乳类动物的eIF-2激酶催化区的同源比对，表明PKZ很可能是一种新的eIF-2激酶。1.2 PKZ的结构特征人、小鼠、大鼠、牛、猪等哺乳动物PKR分别编码551、515、513、533和537个氨基酸组成的蛋白质。这些蛋白质都具有典
9、型的C-末端催化区(eIF2a激酶区域，包含了11个保守的大小不等的亚区域)和N-末端调节区。其中N一端的调控区为dsRNA结合区域(dsRBM)，包含两个一前一后的重复序列(dsRBM1和dsRBM2)。最近研究发现在鱼类中也存在PKR-like，但与哺乳动物不同的是在其N-末端没有双链RNA结合序列，取而代之的是两个Z-DNA结合区域(Z)。N-末端调控区 C-末端eIF2激酶区域Z1Z2图1-1.PKZ结构模式图Fig.1-1.The schematic structural features of PKZ1.3 PKZ的激活机制有证据证明，PKZ的激活需要2个必要的因素，1是Z-DNA
10、与PKR的1个或2个Za结合，2是PKZ的分子间的聚合，形成2个或多个PKZ分子与一条Z-DNA结合的状态。1.4 ZZa是能够特异性识别和结合Z-DNA的蛋白结构域。由于Za存在于ADAR1等Z-DNA结合蛋白中，并特异性地在靶基因启动子附近与Z-DNA结合，调控转录起始和继续。因此，它在一定程度上赋予这些Z-DNA结合蛋白作为基因调控的反式作用因子的作用。Za结构域上均含有一个结合Z-DNA的识别表面，处于该表位与Z-DNA相互作用的天冬酰胺、酪氨酸、色氨酸等在Za序列中非常保守。Za通过水分子介导、氢键、范德华力和CH-作用间接或直接与DNA相互作用，参与相互作用的氨基酸残基都处于a3和
11、ZaC-端的“侧翼”。图1-2 Za的三维结构Fig.1-2 Three dimensional struture of Za domain1.5 草鱼简介草鱼（Ctenopharyngodon idellus）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属。草鱼的俗称有：鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草鱼、草根（东北）、混子、黑青鱼等。英文名：Grass carp 。鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属的唯一种。又称白鲩，草根鱼，厚鱼。体略呈圆筒形，头部稍平扁，尾部侧扁；口呈弧形，无须；上颌略长于下颌；体呈浅茶黄色，背部青灰，腹部灰白，胸、腹鳍略带灰黄，其他各鳍浅灰色（见图）。为中国东部广西至黑龙江等平原地区的特有鱼类。 图1
12、-3草鱼Fig1-3 Grass carp栖息于平原地区的江河湖泊，一般喜居于水的中下层和近岸多水草区域。性活泼，游泳迅速，常成群觅食。为典型的草食性鱼类。在干流或湖泊的深水处越冬。生殖季节亲鱼有溯游习性。已移殖到亚、欧、美、非各洲的许多国家。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一。中国重要淡水经济鱼类中最负盛名者当推草鱼（Ctenopharyngodon idellus ）、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲢(Hypophthalmictuthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)等世界著名的“四大家鱼”，虽均为我国特有
13、鱼类，而草鱼以其独特的食性和觅食手段而被当做拓荒者而移植至世界各地。其体较长，略呈圆筒型，腹部无棱。头部平扁，尾部侧扁。口端位，呈弧形，无须。下咽齿二行，侧扁，呈梳状，齿侧具横沟纹。背鳍和臀鳍均无硬刺，背鳍和腹鳍相对。体呈茶黄色，背部青灰略带草绿，偶鳍微黄色。 草鱼肉性味甘、温、无毒，有暖胃和中之功效，广东民间用以与油条、蛋、胡椒粉同蒸，可益眼明目。其胆性味苦、寒，有毒。动物实验表明，草鱼胆有明显降压作用，有祛痰及轻度镇咳作用。江西民间用胆汁治暴聋和水火烫伤。胆虽可治病，但胆汁有毒，常有因吞服过量草鱼胆引起中毒事例发生。中毒过程主要为毒素作用于消化系、泌尿系，短期内引起胃肠症状，肝、肾功能衰竭
14、，常合并发生心血管与神经系病变，引起脑水肿、中毒性休克，甚至死亡，对吞服草鱼胆中毒者尚无特效疗法，故不宜将草鱼胆用来治病，如必须应用，亦需慎重。1.6 PCR聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方. DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变
