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1、 红豆杉 MYB 1 基因的克隆及其表达 产物的亚细胞定位分析 系系 部 部 城市建设系城市建设系 专专 业业 班 班 生物工程生物工程 07010701 班班 姓姓 名 名 学学 号 号 00711710050071171005 指导教师 指导教师 20102010 年年 6 6 月月 红豆杉 MYB 1 基因的克隆及其表达 产物的亚细胞定位分析 Cloning Of MYB 1 Gene From Taxus And The Subcellular Localization Of Its Expression Product 摘 要 克隆红豆杉叶片细胞中的MYB 1转录因子基因 对基因序列
2、进行初步的生物 信息学分析 再通过构建亚细胞定位载体 对基因的表达产物进行定位分析 本研究首先提取红豆杉细胞的总RNA后 RT PCR得到cDNA第一链 经检验 可以用作模板扩增基因 根据MYB 1基因的ORF设计引物 扩增MYB 1基因 得到 1668bp的完整开放阅读框 编码555个氨基酸 然后对测序结果进行结构域分析 表明其存在DNA结合结构域 并对其二级结构进行了预测 将它与多种的MYB家 族基因进行多序列比对 分析其保守结构域 进一步构建相应的系统进化树 由测序结果设计特异性引物 并成功构建了亚细胞定位载体 4pCAMBIA130 最后 基因枪转化洋葱表皮进行定位分析 证实MYB 1
3、蛋白在核内定1 MYB 位 为进一步分析研究其详细功能奠定了基础 关键词 红豆杉 MYB 1转录因子 进化树分析 亚细胞定位 Abstract Cloning MYB 1 transcription factor genes from Taxus leaf cells gene sequences preliminary bioinformatics analysis and then by constructing the subcellular localization vector for analysis the localization of gene expression prod
4、uct In this study total RNA extracted from Taxus cells first strand cDNA obtained through RT PCR By inspection it can be used as a template to amplified genes According the ORF of MYB 1 gene primers designed to PCR amplification MYB 1 gene We achieved a complete open reading frame of 1668bp of objec
5、tve fragment encoding 555 amino acids Then analysis structural domain of sequencing results indicating that the existence of DNA binding domain and its secondary structure was predicted through alignment with a variety of multiple sequence and analysis the conserved domain then build corresponding p
6、hylogenetic tree further By the sequence specific primers were designed and successfully constructed subcellular localization vector and finally insert into the onion epidermal by gene gun positioning analysis confirmed MYB 1 protein in nuclear localization This result laid a sound foundation for th
7、e next step that the analysis of its function Key words Taxus MYB 1 transcription factor phylogenetic trees subcellular localization 目目 录录 摘要 Abstract 绪论 5 1 有关红豆杉 5 2 有关紫杉醇 5 3 有关MYB基因 6 MYB基因 6 MYB基因编码蛋白 MYB蛋白 的结构特征 6 MYB基因的功能 7 MYB基因的研究进展 7 4 本课题研究的切入点 8 5 研究的目的和意义 9 6 本课题研究的主要内容 9 第一章 MYB 1基因的克隆
8、 10 1 前言 10 2 材料和方法 10 2 1 菌株 质粒和植物材料 10 2 2 试剂 10 2 3 仪器 10 2 4 溶液配置 11 2 5 引物设计 11 2 6 总RNA提取 12 2 7 反转录合成cDNA第一链 14 2 8 MYB 1全长克隆 14 2 8 1 PCR扩增目的基因MYB 1全长 14 2 8 2 割胶回收目的基因片段 MYB 1 15 2 9 目的基因与克隆载体pMD 18T质粒的连接 15 2 10 转化感受态细胞 16 5DH 2 10 1 大肠杆菌感受态细胞的制备 16 5DH 2 10 2 重组质粒转化感受态细胞 17 5DH 2 10 3 挑斑筛
9、选阳性克隆 17 2 10 4 阳性克隆的菌液PCR扩增鉴定 17 2 11 目的基因的测序 18 3 结果与分析 18 3 1 红豆杉叶片细胞总 RNA 的提取和质量分析 18 3 2 反转录得到cDNA第一链 19 3 3 目的基因的PCR扩增 19 3 4 重组质粒的菌液PCR鉴定 20 3 5 目的基因MYB 1的测序结果 20 3 6 MYB 1基因的比对分析 21 4 讨论 21 4 1 RNA 的提取 21 4 2 MYB 1基因的PCR扩增质量 22 第二章 MYB 1基因的生物信息学分析 23 1 前言 23 2 材料与方法 24 3 结果与分析 24 3 1 推导的 MYB
10、 1 基因的氨基酸序列 24 3 2 红豆杉 MYB 1 基本理化性质的预测和分析 25 3 3 红豆杉 MYB 1 跨膜结构预测和分析 25 3 4 红豆杉 MYB 1 功能结构域的预测和分析 25 3 5 红豆杉 MYB 1 亚细胞定位的预测和分析 26 3 6 红豆杉MYB 1 二级结构的预测和分 27 3 7 多序列比对 28 3 8 进化树分析 29 4 讨论 30 第三章 MYB 1基因表达产物的亚细胞定位分析 32 1 前言 32 1 1 基因枪转化 32 1 2 亚细胞定位 33 1 3 亚细胞定位分析的必要性 33 2 材料与方法 33 2 1 菌株 质粒和植物材料 34 2
11、 2 试剂与用品 34 2 3 仪器 34 2 4 溶液配制 35 2 5 扩增含有酶切位点的MYB 1基因 35 2 5 1 质粒的提取 35 2 5 2 以质粒为模板扩增含有酶切位点的MYB 1基因 36 2 5 3 含有酶切位点的MYB 1基因与pMD 18T质粒的连接 37 2 5 4 重组子转化感受态细胞 37 5DH 2 5 5 挑斑筛选阳性克隆 38 2 5 6 菌液PCR鉴定 38 2 5 7 T MYB 1重组子的酶切鉴定 38 2 5 8 亚细胞定位载体质粒pCAMBIA1304的双酶切 39 2 5 9 目的基因与pCAMBIA1304质粒的连接 40 2 5 10 重组
12、子转化感受态细胞 4014 pCAMBIA130 MYB 5DH 2 5 11 挑斑筛选阳性克隆 41 1 5 12 菌液PCR鉴定 41 2 5 13 重组子的酶切鉴定 4114pCAMBIA130 MYB 2 5 14 提取阳性菌液的质粒 42 2 5 15 阳性质粒的酶切验证 23 2 5 16 基因枪转化洋葱表皮细胞 23 2 5 17 融合蛋白的瞬间表达与定位 44 3 结果与分析 44 3 1 含有酶切位点的MYB 1基因的扩增 44 3 2 菌液PCR鉴定 44 3 3 T MYB 1重组子的酶切鉴定 45 3 4 亚细胞定位载体质粒pCAMBIA1304的双酶切 46 3 5
13、重组子的酶切鉴定 4614pCAMBIA130 MYB 3 6 融合蛋白的亚细胞定位 47 4 讨论 48 4 1 重组子的构建 48118 MYBTpMD 4 6 臍组子的朄 4 14pCAMBIA130 MYB 4 3 亚细胞定位 68 致谢 u0 参考文献 1 绪论 1 有关红豆杉 红豆杉是一种濒临灭绝的天然抗癌植物 由于在自然条件下生长缓慢 再 生能力差 所以很长时间以来 世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林 基地 中国已将其列为一级珍稀濒危保护植物 联合国也明令禁止采伐 红豆杉在全球共有十一种 目前我国共有四种和一个变种 即云南红豆杉 西藏红豆杉 东北红豆杉 中国红豆杉和南方红豆
14、杉 变种 东北红豆杉主要 分布在分布于中国的吉林 辽宁 黑龙江三省 中国境内的红豆杉中 东北红 豆杉紫杉醇含量最高 可达万分之三 1 云南红豆杉主要分布在滇西与地洲 等地 西藏红豆杉主要分布在云南西北部 西藏南部和西南部 南方红豆杉主 要分布在滇东 滇西南 滇东 曼地亚红豆杉是我国20世纪90年代中期从加拿大引种而来 原产于美国 加拿大 是一种天然杂交品种 其母本为东北红豆杉 父本为欧洲红豆杉 引 种的曼地亚红豆杉生物特性稳定 没有发生变异 紫杉醇含量接近甚至高于原 产地 我们的实验就是以曼地亚红豆杉为材料的 2 有关紫杉醇 紫杉醇 Taxo1 是2O世纪7O年代初从短叶红豆杉树皮中提取分离得
15、到的一种 四环二萜酰胺类化合物 分子式为 C47H51NO14 是红豆杉属植物中的一种复杂 的天然次生代谢物 主要由紫杉烷环和侧链组成 2 其生物合成非常复杂 全过程约20步酶促反应 涉及多步环化 羟基化 酰基化反应 3 紫杉醇是一种微管特异性药物 它能够稳定微管并阻止微管解聚 使细胞分裂 停止于有丝分裂期 从而抑制细胞的增殖 4 临床研究表明 紫杉具有广谱 而高效的抗癌活性 对于治疗卵巢癌 乳腺癌等疗效突出 但是由于含量少 提取困难等诸多因素 高纯度紫杉醇价格昂贵 每公斤200万元人民币左右 因 此 近年来国内外许研究人员 实验室和公司一直试图通过生物合成 化学合 成 微生物提取 组织和细胞
16、培养 寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短 缺问题 研究紫杉醇的生物合成 尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向 的提高合成效率 克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大 从理论上来说这是一个好方法 但是紫杉醇的合成途径非常复杂 涉及到多种 酶以及很多分支途径 单纯依靠转化一 两种限速酶基因 只能保证转入的限 速酶表达量提高 使之不再是限速因素 但其它阶段对于最终产量的限制依然 存在 而且同时转入多种基因的可行性非常低 这种方法的缺陷很明显 若采用化学合成 如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭 经过四步化学过 程可合成紫杉醇 为合成紫杉醇提供了新途径 5 但化学合成从实质意义上 说还没有取得彻底的突破 目前还不具备应用价值 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇 能够利用真菌生长速度快的优势 但 目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求 而且还存在很 多不确定因素 1 生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌 其紫杉 醇含量极微 并且这些真菌的培养和大规模发酵困难 菌株衰退也是一个难题 另外 红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一 是工厂 化大规模生产紫杉
